王知平

（山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西太原030012）

冬凌草甲素（oridonin）屬于貝殼杉烯二萜類化合物，是從唇形科（Labiatae）香茶菜屬（Isodon）植物冬凌草中提取出的主要成分，該物質(zhì)具有抗癌活性［1-2］。由于冬凌草甲素味苦，水溶性、脂溶性較差，不適合直接制備成注射液或者乳劑，且制備片劑的生物利用度較低。有文獻(xiàn)報(bào)道，采用加入有機(jī)溶劑和表面活性劑的方法可增加冬凌草甲素的溶解度制備成靜脈注射劑，但此種方法改進(jìn)容易引起不良反應(yīng)［3］。通過(guò)對(duì)冬凌草甲素的性質(zhì)進(jìn)行分析，決定將其制為脂質(zhì)體，增加溶解度，提高藥物的生物利用度。文獻(xiàn)報(bào)道，多采用薄層色譜法、反相高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法等方法測(cè)定冬凌草甲素的含量。本文采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定冬凌草甲素及其自制脂質(zhì)體的含量，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，為其脂質(zhì)體的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1260系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司，G1314B DAD檢測(cè)器，G1311C四元泵，G1329B標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱）。冬凌草甲素原料藥（南京邦諾生物科技有限公司，純度＞98.0%）；冬凌草甲素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111721-200501，純度＞98.5%）；乙腈、甲醇均為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司），其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（55∶45）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：241 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按冬凌草甲素峰計(jì)不低于2 000，冬凌草甲素與雜質(zhì)峰之間的分離度應(yīng)符合要求R＞1.5，冬凌草甲素峰的拖尾因子小于 1.5。

在此色譜條件下，冬凌甲素對(duì)照品及冬凌甲素鈉脂質(zhì)體色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 冬凌甲素對(duì)照品、冬凌甲素鈉脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體色譜圖

2.2 線性試驗(yàn)

對(duì)照品貯備液的配制：精密稱取冬凌草甲素對(duì)照品10 mg，置于50 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至50 mL刻度線，搖勻，即得。

對(duì)照品溶液的配制：取6個(gè)洗凈的10 mL容量瓶，分別精密移取對(duì)照品貯備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至10 mL刻度線，搖勻，得到濃度分別為10 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。橫坐標(biāo)為冬凌草甲素的量（μg），縱坐標(biāo)為冬凌草甲素的峰面積（A），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行回歸，回歸方程為：A=22.18C+6.15，r=0.999 5。結(jié)果表明，冬凌草甲素在10～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取6份濃度為40 μg/mL的對(duì)照品溶液，在室溫下放置，分別于 0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 進(jìn)樣 20 μL，得到色譜圖，記錄峰面積。結(jié)果表明：冬凌草甲素峰面積的RSD為0.72%，表明樣品溶液在12 h之內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密配制濃度為 10 μg/mL，40 μg/mL，80 μg/mL的對(duì)照品溶液各3份，同一天內(nèi)早、中、晚各進(jìn)樣分析兩次，記錄色譜圖，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算藥物濃度，計(jì)算日間精密度、日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間精密度的RSD分別為0.8%和1.2%，準(zhǔn)確度在90%～110%之間（測(cè)定的平均藥物濃度與實(shí)際濃度的比值）。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密量取冬凌草甲素脂質(zhì)體6份，加入甲醇溶解超聲10 min破乳，使溶液澄清，流動(dòng)相定容，并搖勻，配制成一定濃度的溶液，取20 μL進(jìn)樣，并記錄色譜圖，將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到冬凌草甲素脂質(zhì)體中藥物的含量。結(jié)果顯示，冬凌草甲素的含量RSD為1.92%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率試驗(yàn)

精密量取空白脂質(zhì)體1.0 mL共9份，置于10 mL的容量瓶中，分別加入冬凌草甲素對(duì)照品，配成相當(dāng)于樣品含量的80%，100%，120%低、中、高濃度的樣品溶液各三份。將上述溶液，加入適量甲醇溶解超聲破乳，進(jìn)樣，得到色譜圖，記錄峰面積，代入回歸方程，得到冬凌草甲素脂質(zhì)體中藥物的含量。再將測(cè)得量與加入量相比得到冬凌草甲素的加樣回收率，結(jié)果顯示低、中、高三個(gè)濃度的平均回收率分別為100.3%，99.9%，99.5%，RSD分別為1.2%，0.58%，0.56%。平均回收率為99.9%，平均RSD為0.77%。

2.7 冬凌草甲素脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

包封率是指包封于脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量占脂質(zhì)體混懸液藥物總量的比例。

洗脫液用PBS水溶液，配制方法：取磷酸二氫鉀6.8 g，純凈水稀釋至1 000 mL，采用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。

取自制冬凌草甲素脂質(zhì)體樣品3批（批號(hào)為20170504，20170511，20170515），每批取 3 份，分別上樣于已預(yù)先用生理鹽水平衡好的Sephadex-G50凝膠柱，洗脫液以0.5 mL/min的流速洗脫，將藥物洗脫液分別收集在10 mL的容量瓶中，加甲醇超聲破乳，流動(dòng)相定容，取20 μL進(jìn)樣，得到色譜圖，記錄峰面積，代入回歸方程，計(jì)算得到溶液中冬凌草甲素的質(zhì)量m1。

精密吸取同樣量未過(guò)柱的冬凌草甲素脂質(zhì)體三批（批號(hào)為 20170504，20170511，20170515），每批取3份，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解超聲破乳，流動(dòng)相定容，進(jìn)樣，得到色譜圖，記錄峰面積，代入回歸方程，計(jì)算藥物質(zhì)量，取平均值，得總藥物質(zhì)量m1。計(jì)算包封率，其包封率分別為95.82%、94.39%、94.75%，平均包封率為94.99%。

3 討論

本研究中，破乳影響藥物的釋放，影響藥物包封率的測(cè)定，進(jìn)而影響脂質(zhì)體質(zhì)量的好壞，而破乳選擇的方法是超聲，因此需要通過(guò)選擇合適的超聲時(shí)間進(jìn)行破乳［2］。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)冬凌草甲素和脂質(zhì)體中輔料在200～400 nm波長(zhǎng)下掃描，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在241 nm附近有最大吸收，因此選擇241 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

有關(guān)包封率的測(cè)定大多采用離心超濾法、凝膠過(guò)濾法、透析法、葡聚糖凝膠柱層析法等。在前期研究中，將這幾種方法都做了比較，4種方法測(cè)得結(jié)果葡聚糖凝膠柱層析法的結(jié)果最好，因此選擇了比較經(jīng)典的葡聚糖凝膠柱層析法測(cè)定［4］。

本文建立高效液相色譜法測(cè)定自制冬凌草甲素脂質(zhì)體中冬凌草甲素的含量，方法簡(jiǎn)便，容易操作，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，包封率測(cè)定也符合要求。