吳紅梅 陸茂 歐美 羅媛元

[摘要] 目的 檢測(cè)特應(yīng)性皮炎（AD）患者皮膚馬拉色菌菌量，探討其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 方法 選取成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017年4～9月就診的輕中重度AD患者各20例，采集其面部、上肢皮損區(qū)和非皮損區(qū)以及20例健康對(duì)照者相應(yīng)區(qū)域的皮膚鱗屑標(biāo)本，采用真菌熒光染色法在高倍鏡下記錄馬拉色菌的密度，并分析馬拉色菌密度與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 結(jié)果 輕中重度AD患者面部皮損區(qū)、非皮損區(qū)馬拉色菌密度均明顯高于上肢皮損區(qū)、非皮損區(qū)（P < 0.05），輕中重度AD患者各部位馬拉色菌密度均明顯高于健康對(duì)照者相應(yīng)區(qū)域（P < 0.05），AD患者各部位馬拉色菌密度與病情嚴(yán)重程度均無相關(guān)性（P > 0.05）。 結(jié)論 AD患者皮膚馬拉色菌菌量與部位有關(guān)，與病情嚴(yán)重程度無關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 特應(yīng)性皮炎；馬拉色菌；熒光染色法；病情嚴(yán)重程度

[中圖分類號(hào)] R758 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（b）-0096-04

[Abstract] Objective To detect the amount of Malassezia in the skin of patients with atopic dermatitis （AD）， and explore its correlation with the disease severity. Methods 20 mild， 20 moderate and 20 severe AD patients were selected from the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College from April to September 2017. Skin scales were collected as samples from the lesion and non lesion areas on the face and upper limb of AD patients as well as the corresponding areas of 20 healthy control subjects. The density of Malassezia was recorded at high magnification by fluorescent staining method. Then the correlation between the density of Malassezia and the disease severity was analyzed. Results The density of Malassezia in the lesion and non lesion areas on the face of the mild， moderate and severe AD patients was significantly higher than those of the upper limbs （P < 0.05）. The density of Malassezia in each skin area of mild， moderate and severe AD patients was significantly higher than that of healthy control subjects （P < 0.05）. The density of Malassezia in each skin area of AD patients was not correlated with the disease severity （P > 0.05）. Conclusion The amount of Malassezia in the skin of AD patients is related to the site， but not to the disease severity.

[Key words] Atopic dermatitis； Malassezia； Fluorescent staining method； Disease severity

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種臨床常見的復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能是遺傳因素、免疫因素、有缺陷的皮膚屏障功能、環(huán)境因素、感染因素等共同作用的結(jié)果。與感染因素有關(guān)的微生物主要有金黃色葡萄球菌，其次是真菌（包括馬拉色菌及念珠菌等）[1-2]。目前國(guó)外有關(guān)馬拉色菌在AD患者皮膚定植情況的報(bào)道較多，但檢測(cè)結(jié)果差異較大，可能與種族、地區(qū)及檢測(cè)方法有關(guān)[3-4]，而國(guó)內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道很少。本研究采用真菌熒光染色法檢測(cè)AD患者面部、上肢皮損區(qū)和非皮損區(qū)馬拉色菌菌量，并分析其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）2017年4～9月就診的輕中重度AD患者各20例，病情嚴(yán)重程度采用濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)評(píng)分法：<7分為輕度，7～21分為中度，>21分為重度[5]。其中輕度AD，男12例，女8例；平均年齡（4.56±3.93）歲；平均病程（15.69±8.56）個(gè)月。中度AD，男11例，女9例；平均年齡（5.34±4.28）歲；平均病程（19.14±10.02）個(gè)月。重度AD，男9例，女11例，平均年齡（7.27±4.45）歲；平均病程（20.69±12.14）個(gè)月。20名健康對(duì)照者來自我院工作人員子女，男8例，女12例，平均年齡（6.43±4.79）歲。各組研究對(duì)象性別、年齡、病程等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②面部、上肢均有皮損區(qū)和非皮損區(qū)；③檢測(cè)前2周每周洗浴3～5次；④能配合檢測(cè)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①2周內(nèi)使用抗真菌藥物和糖皮質(zhì)激素史；②采樣前24 h內(nèi)在采樣部位使用任何藥物或醫(yī)用護(hù)膚品；③采樣前24 h內(nèi)進(jìn)行洗??；④伴有其他皮膚?。虎莅橛袗盒阅[瘤或其他嚴(yán)重疾患。

1.3 檢測(cè)方法

用市售透明膠帶（寬1 cm）采集AD患者面部、上肢皮損區(qū)和非皮損區(qū)以及健康對(duì)照者相應(yīng)區(qū)域的皮膚鱗屑，所有檢測(cè)對(duì)象均以相同力度將膠帶與皮膚緊密粘貼，每個(gè)區(qū)域重復(fù)粘貼3次，每次5 s。然后將膠帶均勻貼附在滴有真菌熒光染色液（南京漢瑞生物科技有限公司）的載玻片上，在BX51TF型熒光顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）下觀察馬拉色菌并記數(shù)。參考Conti等[7]的標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行改良，讀取孢子密集區(qū)，取5個(gè)高倍鏡視野的菌量，取平均數(shù)：①≤5個(gè)，為-；②>5～15個(gè)，為+；③>15～30個(gè)，為++；④>30個(gè)，為+++。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組單向有序分類資料比較采用秩和檢驗(yàn)，多組單向有序分類資料比較采用Ridit分析，雙向有序分類變量間相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD患者、健康對(duì)照者各部位馬拉色菌密度比較

AD患者、健康對(duì)照者各部位馬拉色菌密度比較結(jié)果顯示：①AD患者面部皮損區(qū)、非皮損區(qū)和健康對(duì)照者面部馬拉色菌密度均明顯高于上肢皮損區(qū)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；②AD患者各部位馬拉色菌密度均明顯高于健康對(duì)照者相應(yīng)區(qū)域，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；③AD患者同一部位皮損區(qū)與非皮損區(qū)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

按病情嚴(yán)重程度分類分析，結(jié)果顯示：①AD患者面部皮損區(qū)、非皮損區(qū)馬拉色菌密度均明顯高于上肢皮損區(qū)、非皮損區(qū)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；②輕、中、重度AD患者與健康對(duì)照者同一部位比較，馬拉色菌密度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其中AD患者各部位馬拉色菌密度均明顯高于健康對(duì)照者相應(yīng)區(qū)域，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），輕、中、重度AD患者同一部位比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；③AD患者同一部位皮損區(qū)與非皮損區(qū)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 AD患者各部位馬拉色菌密度與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

AD患者各部位馬拉色菌密度與病情嚴(yán)重程度均無相關(guān)性（P > 0.05）。見表3。

3 討論

馬拉色菌是正常人皮膚的常駐菌群，其與AD發(fā)病的關(guān)系尚不清楚?；诜蛛x培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生理生化學(xué)馬拉色菌鑒定方法由于存在培養(yǎng)環(huán)節(jié)對(duì)檢測(cè)的影響，并不能真實(shí)反映馬拉色菌在皮膚原位的定植情況。本研究在取材時(shí)采用膠帶直接粘貼表皮，未改變標(biāo)本中真菌在皮膚表面的位置和數(shù)量，因此可以直觀檢測(cè)AD患者皮膚原位的馬拉色菌菌量。馬拉色菌在AD患者和正常人群皮膚上主要以孢子形態(tài)存在，且載量較少，臨床上常用乳酸酚棉藍(lán)、派克墨水等染色法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)[8-10]。近年來，真菌熒光染色法逐漸應(yīng)用于馬拉色菌鏡檢，它通過特殊的熒光素與真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見真菌清晰的輪廓，便于尋找和識(shí)別，同時(shí)熒光染料親和力高，能使少量真菌著色，提高了對(duì)菌載量少的標(biāo)本的檢出率[11-13]。已有研究表明熒光染色法較乳酸酚棉藍(lán)染色法易于觀察馬拉色菌的真菌結(jié)構(gòu)及出芽模式，更能真實(shí)準(zhǔn)確地反映馬拉色菌在皮膚原位的定植情況[14]。

馬拉色菌具有嗜脂性，好定植于頭頸部等皮脂溢出部位，Sugita等[15]對(duì)從AD患者皮膚鱗屑中提取的馬拉色菌DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示AD患者頭頸部的馬拉色菌菌量是四肢的6.8倍，本研究結(jié)果也顯示AD患者、健康對(duì)照者面部馬拉色菌密度明顯高于上肢。本研究還顯示AD患者各部位馬拉色菌密度均高于健康對(duì)照者相應(yīng)區(qū)域，我們推測(cè)可能的原因如下：AD患者普遍存在皮膚屏障功能障礙，定植于皮膚表面的馬拉色菌容易進(jìn)入體內(nèi)，然后通過特異性IgE抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)釋放炎性介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)不僅可使局部炎癥加重引起瘙癢、搔抓，破壞皮膚屏障功能，還能影響與皮膚屏障功能有關(guān)的絲聚蛋白和神經(jīng)酰胺的合成[16-17]，抑制皮膚表面具有抵御病原微生物活性的抗菌肽合成[18]，上述效應(yīng)都更加有利于馬拉色菌的定植和入侵，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致AD患者各部位馬拉色菌菌量高于正常人相應(yīng)區(qū)域。此外，有研究表明AD患者皮損區(qū)和非皮損區(qū)皮膚屏障功能、皮膚表面pH值、皮脂含量等與馬拉色菌定植難易程度有關(guān)的生理參數(shù)無顯著差異[19-20]，提示皮損區(qū)和非皮損區(qū)的馬拉色菌菌量可能也無明顯差異。

目前關(guān)于AD患者皮膚馬拉色菌菌量與疾病嚴(yán)重程度關(guān)系的研究結(jié)果存在差異。Kaga等[21]研究結(jié)果顯示重度AD患者頭頸部皮損區(qū)馬拉色菌菌量是輕中度患者和健康對(duì)照者的2～5倍。Akaza等[22]研究結(jié)果顯示中重度女性患者面部馬拉色菌菌量多于輕度患者，但女性軀干上部和男性面部、軀干上部馬拉色菌菌量與病情嚴(yán)重程度無關(guān)。既往有研究表明AD患者血清中抗馬拉色菌特異性IgE抗體水平明顯高于健康對(duì)照者，而且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[23-24]，提示AD患者病情嚴(yán)重程度與進(jìn)入體內(nèi)引起免疫反應(yīng)的馬拉色菌菌量有關(guān)，而進(jìn)入體內(nèi)馬拉色菌的多少不僅由皮膚表面馬拉色菌菌量高低來決定的，皮損的性質(zhì)、皮膚屏障功能受損程度、局部免疫反應(yīng)也可能對(duì)馬拉色菌入侵的難易程度有影響。此外，AD患者雖然存在皮膚屏障功能受損等有利于馬拉色菌定植的因素，但也有不利因素，例如皮脂含量與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[25-27]，隨著病情嚴(yán)重程度增加，皮脂含量的下降不利于馬拉色菌的定植。

綜上所述，皮膚表面定植的馬拉色菌可能僅僅是AD發(fā)病的啟動(dòng)因素之一，患者的病情嚴(yán)重程度受多種與馬拉色菌定植和入侵有關(guān)因素的影響，與皮膚表面馬拉色菌菌量相關(guān)性尚不明確。

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（收稿日期：2018-03-01 本文編輯：金 虹）