劉慧芬，王 靜，黃建美，陳秋鳳，陳蕃錦，馬 曉，朱國超，宋東縈， 聶國興，李學(xué)軍

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007)

鳙(Hypophthalmichthysnobilis)又叫花鰱，是我國著名的四大家魚之一，在我國淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。鳙的養(yǎng)殖歷史悠久，最早可以追溯到一千多年前的唐代，鳙人工繁殖技術(shù)的成功，更是推動了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。根據(jù)2017年《中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》的統(tǒng)計(jì)，我國鳙產(chǎn)量從2007年的213.5萬噸增至2016年的348.02萬噸，在淡水養(yǎng)殖魚類年產(chǎn)量中位居第四，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益[2]。

目前，國內(nèi)已有許多關(guān)于鳙的遺傳多樣性水平檢測和種質(zhì)評估工作。李思發(fā)等[3]利用線粒體DNA分析了長江中下游鳙群體的多樣性，發(fā)現(xiàn)鳙的遺傳多樣性豐富，但是群體間存在顯著的遺傳差異；張德春等[4]采用RAPD方法分析了長江中游鳙自然繁殖群體和人工繁殖群體的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)人工繁殖群體的遺傳多樣性明顯低于自然群體；張敏瑩等[5]研究了長江下游鳙放流群體和天然捕撈群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)放流群體與天然捕撈群體間的遺傳多樣性相差不大；耿波等[6]利用17個鳙微衛(wèi)星標(biāo)記分析了四川瀘州和江西鄱陽湖兩個鳙種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)兩個地理種群間存在種群內(nèi)變異；嚴(yán)駿驄等[7]運(yùn)用AFLP技術(shù)分析了中國土著鳙群體和移居群體間的遺傳結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)移居群體的遺傳多樣性顯著低于國內(nèi)土著群體，出現(xiàn)顯著分化。這些研究主要集中在湖北、湖南、廣東、四川、江西、黑龍江等地區(qū)，但至今尚未有關(guān)于河南省鳙遺傳背景的研究報道。

鳙作為河南重要經(jīng)濟(jì)魚類之一，市場需求量較大，既有本地自繁苗種，也有從廣東、湖北、安徽、天津等地引進(jìn)苗種。為了厘清河南地區(qū)養(yǎng)殖鳙群體的遺傳背景，切實(shí)做好親本遺傳管理工作，對河南地區(qū)鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行檢測勢在必行。

目前關(guān)于鳙遺傳多樣性的分析多采用DNA分子標(biāo)記，但至今尚未有基于線粒體COI基因(細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ)分析鳙遺傳背景的研究報道。COI基因作為線粒體DNA上較為保守的序列,被認(rèn)為是研究群體遺傳多樣性非常有效的工具。因此，本研究利用線粒體COI基因?qū)幽鲜〉?1個鳙養(yǎng)殖群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，研究不同群體鳙的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在為河南省鳙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料采集與處理

鳙樣本于2016年8-10月間分別取自河南省11個養(yǎng)殖場(樣品具體采集地點(diǎn)見表1)。每個群體隨機(jī)選15尾，剪取部分肌肉組織保存在95%酒精中，用于總DNA提取。

表1 養(yǎng)殖鳙樣品信息

1.2 DNA提取

基因組DNA的提取采用酚-氯仿法，具體步驟如下：取100 mg 左右肌肉組織，加入495 μL裂解緩沖液(1mol/L Tris-HCl 25 μL，0.5 mol/L EDTA 50 μL，NaCl 5 mol/L)，5 μL 蛋白酶K(濃度為 20 mg/mL)，55 ℃恒溫水浴鍋消化2～3 h。加入等體積的飽和酚，緩慢轉(zhuǎn)動15 min，12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇混合液(24∶1)，緩慢轉(zhuǎn)動10 min后，12 000 r/min 離心10 min。吸取上清液，加入800 μL提前預(yù)冷的無水乙醇(-20 ℃)沉淀DNA，70%乙醇洗滌一次，干燥，加入適量ddH2O溶解。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，Nanodrop 2 000檢測DNA濃度，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增和測序

用于擴(kuò)增mtCOI序列的引物來自Ivanova等[8]，具體序列見表2。PCR反應(yīng)總體系25 μL，其中包括Buffer 2.5 μL，Mg2+2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，Taq酶0.25 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃變性30 s，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照后，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

表2 實(shí)驗(yàn)中所用引物

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序完成后，DNA序列用CLUSTALX 1.81軟件[9]進(jìn)行比對；用DNAsp 5.0軟件[10]統(tǒng)計(jì)核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)和群體遺傳分化系數(shù)(FST)。通過PMAL4.3軟件[11]和Adaptive Evolution Server在線平臺(http://datamonkey.org//dataupload.php)檢測鳙養(yǎng)殖群體線粒體COI基因受選擇情況，用非同義替代率(dN)與同義替代率(dS)的比值來估算選擇壓力。用ARLEQUIN 3.1軟件[12]進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)；用MEGA 4.0軟件[13]的Kimura 雙參數(shù)模型計(jì)算單倍型之間的遺傳距離，并按照鄰接法(neighbor joining method，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹各節(jié)點(diǎn)支持率采用Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)置信度；用TCS 1.2軟件[14]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 鳙群體線粒體COI序列和遺傳多樣性分析

對采自河南地區(qū)11個不同養(yǎng)殖場的鳙進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得線粒體COI序列，去除兩端引物后，得到的目的片段長度為652 bp。經(jīng)比對分析發(fā)現(xiàn)鳙各群體堿基含量差別不大，A、T、C、G平均含量分別為25.3%、29.5%、27.3%、17.9%，A+T含量(54.8%)高于C+G含量(45.2%)。165尾鳙樣品共檢測到7個基因變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)5個，單突變位點(diǎn)2個。鳙群體中檢測到了14個單倍型(表3)，其中群體間共享單倍型10個，特有單倍型4個。各群體單倍型多樣性范圍在0.714 29～1.000 00之間，其中單倍型多樣性最高的是5號群體，最低的是8號群體；核苷酸多樣性范圍在0.001 27～0.003 24之間，其中核苷酸多樣性最高的是5號群體，最低的是2號群體?；蛄鞣治鲲@示11個鳙養(yǎng)殖群體間的平均基因流為5.01。

2.2 鳙群體間的遺傳分化與遺傳距離

用ARLEQUIN 3.1軟件計(jì)算不同養(yǎng)殖場鳙群體間的遺傳分化(表4)，結(jié)果顯示鳙兩兩群體間遺傳分化系數(shù)(FST)值在-0.166 67～0.275 08間，有1組發(fā)生極大的遺傳分化(FST>0.25)，6組發(fā)生較大的遺傳分化(0.15

對不同養(yǎng)殖場鳙群體進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，結(jié)果顯示(表5)鳙群體主要的變異來自群體內(nèi)(97.65%)，群體間變異所占比例較低，僅為4.60%，并且3組分子遺傳變量間的差異均未達(dá)到顯著水平。

表3 河南省鳙養(yǎng)殖群體遺傳多樣性信息

注：Hd為單倍型多樣性，π為核苷酸多樣性。

表4 養(yǎng)殖鳙群體間遺傳分化系數(shù)(FST，對角線下方)和遺傳距離(D，對角線上方)

*表示差異顯著(P<0.05)。

表5 養(yǎng)殖鳙群體AMOVA分析

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析不同養(yǎng)殖場鳙群體間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果顯示11個養(yǎng)殖場的鳙群體交叉聚在一起，沒有形成明顯的地理格局分布(圖1)。

通過單倍型網(wǎng)絡(luò)分析，可以看出14個單倍型在各群體中的分布情況以及單倍型之間的演化關(guān)系。共享單倍型散布在不同的養(yǎng)殖群體中，沒有按照地理區(qū)域聚類，這一結(jié)果進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果(圖2)。

圖1 基于mtCOI基因構(gòu)建河南地區(qū)養(yǎng)殖鳙NJ樹

圖2 TCS計(jì)算mtCOI基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 選擇壓力分析

為檢驗(yàn)是否有選擇壓力作用在人工養(yǎng)殖鳙群體上，通過PAML軟件對11個鳙養(yǎng)殖群體的線粒體COI基因進(jìn)行選擇壓力分析和位點(diǎn)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除5號群體外，所有養(yǎng)殖群體的dN/dS比值均為0，表明在這些群體中，所有核苷酸的替換均為同義替換，沒有出現(xiàn)氨基酸的改變。當(dāng)把11個群體混為一組時，檢測到83號位點(diǎn)的dN/dS比值為0.17(P>0.05)，群體受負(fù)向選擇影響。綜上所述，鳙養(yǎng)殖群體的線粒體COI基因主要受到負(fù)向選擇影響，沒有受到正選擇作用。

3 討論

3.1 河南省鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性

遺傳多樣性是評價物種資源狀況的重要依據(jù)之一，決定了物種的生存力和適應(yīng)性，是優(yōu)良性狀選育的基礎(chǔ)[15,16]。本研究采集的河南省鳙養(yǎng)殖個體有來自湖北、廣州、安徽、天津的苗種，也有本地自繁種群，基本上代表了河南省養(yǎng)殖鳙種質(zhì)資源狀況。利用線粒體COI基因?qū)?1個鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，165尾鳙樣品中共檢測到14個單倍型，其中群體間共享單倍型10個，特有單倍型4個。這4個特有單倍型中，hap11和hap12為本地自繁苗種所特有，hap2為湖北苗種所特有，hap14為天津苗種所特有，廣州和安徽鳙群體沒有發(fā)現(xiàn)特有單倍型。

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的兩個重要參數(shù)。在本研究中，11個群體的平均單倍型多樣性為0.862 37，平均核苷酸多樣性為0.002 23；其中，5號群體(本地自繁)各參數(shù)值最高，2號群體(廣州)和8號群體(河南駐馬店)各參數(shù)值較低。本研究11個群體的遺傳多樣性整體要高于單淇等[17]報道的江西瑞昌(Hd為0.6883，π為0.00511)、湖南長沙(Hd為0.237 9，π為0.001 91)和天津?qū)幒?Hd為0.445 9，π為0.006 67)三個鳙群體。這也可能與所選分子標(biāo)記不同，線粒體DNA不同區(qū)段的進(jìn)化速率差異有關(guān)。

鳙在河南省的養(yǎng)殖模式主要為池塘混養(yǎng)中搭配養(yǎng)殖，但是近年來由于價格提升，才開始增加養(yǎng)殖量。5號群體和8號群體雖然都是人工繁殖群體，但是8號群體遺傳多樣性明顯低于5號群體。養(yǎng)殖群體表現(xiàn)出單倍型多樣性貧乏，遺傳多樣性偏低，反映其育苗親本數(shù)量少。人工養(yǎng)殖條件下依靠少量親本進(jìn)行多代的連續(xù)繁殖，容易導(dǎo)致群體發(fā)生瓶頸效應(yīng)和近交衰退現(xiàn)象，致使其遺傳多樣性水平出現(xiàn)下降。

AMOVA分析結(jié)果顯示，養(yǎng)殖鳙的遺傳變異主要來自群體內(nèi)(97.65%)，群體間的遺傳差異較低。養(yǎng)殖鳙群體的NJ系統(tǒng)樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均未檢測到明顯的地理譜系結(jié)構(gòu)。NJ聚類樹發(fā)現(xiàn)湖北、廣州、安徽、天津以及河南本地鳙群體間存在著較多的交叉和滲透。11個群體單倍型網(wǎng)絡(luò)聚類關(guān)系與NJ聚類的結(jié)果類似，各群體單倍型基本交叉在一起。產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能是人工繁殖造成的結(jié)果。養(yǎng)殖群體在選育過程中是以經(jīng)濟(jì)性狀為目標(biāo)，各養(yǎng)殖群體在選育過程中部分親本的遺傳背景可能存在交叉[18,19]。因此，在鳙繁育工作中，需要加強(qiáng)親本的遺傳背景檢測，選擇遺傳變異高的個體作為親本，才能保證人工繁殖后代遺傳多樣性和養(yǎng)殖性能。

3.2 鳙養(yǎng)殖群體的選擇壓力

遺傳、變異和選擇是生物進(jìn)化的主要動力[20]。對于大多數(shù)養(yǎng)殖魚類群體，在人工繁殖和養(yǎng)殖過程中，包含著有意或無意的選擇。基因所受到的選擇壓力往往只表現(xiàn)在部分位點(diǎn)上，而不會表現(xiàn)在整條基因序列上[21]。選擇壓力位點(diǎn)檢測結(jié)果表明，人工養(yǎng)殖鳙群體線粒體COI基因上留下了選擇信號。通常認(rèn)為非同義突變(dN)與同義突變(dS)的比值大于1，基因受正向選擇的影響；dN/dS的比值小于1，基因受純化或負(fù)向選擇的影響[22]。本研究中鳙所有養(yǎng)殖群體線粒體COI基因的dN/dS比值均小于1，說明鳙養(yǎng)殖群體主要受到純化選擇影響。從進(jìn)化的角度看，群體遺傳變異是自然環(huán)境與人工選擇共同作用的結(jié)果。在自然環(huán)境條件下，沒有巨大環(huán)境變化時更多受到的是純化選擇[23]。養(yǎng)殖鳙群體的壓力分析結(jié)果，暗示當(dāng)前的人工選擇對鳙線粒體基因的作用有限。

本研究選用線粒體COI基因檢測選擇壓力。線粒體COI基因編碼細(xì)胞色素氧化酶，是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員。Liu等[24]分別用線粒體基因和核基因檢測了鰍超科魚類的選擇壓力，發(fā)現(xiàn)線粒體COI基因受負(fù)向選擇的影響最大。因此，下一步研究我們將選擇更多的基因去證實(shí)養(yǎng)殖鳙群體受到的選擇作用。

綜上所述，本研究中河南省11個鳙養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳分化差異較大，遺傳背景存在交叉。鳙作為我國主要的養(yǎng)殖魚類之一，不同地區(qū)間的引進(jìn)和交流比較頻繁。人工養(yǎng)殖鳙需要優(yōu)良種質(zhì)，但是不當(dāng)?shù)囊N和人工養(yǎng)殖會使鳙群體出現(xiàn)種質(zhì)混雜和優(yōu)良種質(zhì)退化現(xiàn)象?；诖?，建議苗種繁育場在引進(jìn)苗種時要對其遺傳背景進(jìn)行考察分析，建議加大引種的數(shù)量與范圍，打破瓶頸效應(yīng)；另外一方面，人工繁殖時建議進(jìn)行優(yōu)良親本選育，增加繁殖親本數(shù)量，采取家系選育技術(shù)提高選育效率，避免近交衰退帶來的風(fēng)險并有利于保持鳙苗種的遺傳多樣性。