劉亞秋,王志堅,李新輝,常藕琴

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380； 2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室， 水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400715)

魚類的腎臟發(fā)育經(jīng)過前腎和中腎兩個階段[1]，前腎的結(jié)構(gòu)比較簡單，而中腎的結(jié)構(gòu)趨于復(fù)雜[2]；對于魚類腎臟發(fā)育的研究，國外從 20 世紀(jì) 50年代開始已有少量文獻報道。國內(nèi)的相關(guān)研究很少，僅發(fā)現(xiàn)研究者對鲇(Silurusasotus)[3]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[4]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[5]以及貝氏高原鰍(Trilophysableekeri)[6]前腎和中腎的發(fā)生進行了較詳細(xì)的描述。大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)，屬于鯉形目花鰍科副泥鰍屬，是一種底棲生活的小型經(jīng)濟魚類[7]。目前主要分布于中國的長江中下游、珠江流域以及東南亞等地區(qū)[8]。在低氧環(huán)境下，大鱗副泥鰍存在腸道輔助呼吸的習(xí)性[9]。對大鱗副泥鰍的系統(tǒng)性研究發(fā)現(xiàn)，其仔稚魚發(fā)育及各器官系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生上都表現(xiàn)出一定特殊性[10-12]。本研究通過對大鱗副泥鰍體腎胚后發(fā)育過程的觀察，探討魚類腎這一重要器官發(fā)生、發(fā)育的一般規(guī)律，為魚類發(fā)育生物學(xué)積累組織形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

大鱗副泥鰍受精卵由本實驗室提供，同一批受精卵于2015年4月22日孵化出膜，飼養(yǎng)50 d，于6月12日結(jié)束，飼養(yǎng)于容積60 L的3個循環(huán)水族缸內(nèi)，飼養(yǎng)期間循環(huán)水族缸水溫21～23 ℃，光照周期12L∶12D，微流水飼養(yǎng)。水質(zhì)參數(shù)：溶氧為(7.13±0.61)mg/L，氨氮小于0.02 mg/L，pH 7.6～8.1。4日齡仔魚開始投喂豐年蟲(天津市丹陽水產(chǎn)科技有限公司)，10日齡開始投喂混合餌食(豐年蟲和微顆粒S1飼料)，20日齡開始完全投喂微顆粒S3號飼料，飼料均購自于山東升索漁業(yè)飼料研究中心，投喂之前清除污物。

1.2 方法

仔魚出膜后24 h作為1日齡仔魚。從初孵仔魚(仔魚剛出膜)開始取材，10日齡前(含10日齡)每天早上8∶00投喂前取材1次，10日齡后每2～5 d取樣1次，每次取10～12尾并測量其全長，取材截止于仔魚出膜50 d。每次取10～12個組織樣品Bouin’s液固定。材料均以石蠟包埋，切片厚度5 μm，分別以橫向和縱向兩種方式進行切片，之后進行蘇木精-伊紅(haematoxylin-eosin,H.E)染色，中性樹膠封片。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每項指標(biāo)采用IPP圖像分析軟件隨機選取 30 個樣本測量相關(guān)數(shù)據(jù)。制片后采用 NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng)觀察、照相。每日齡仔稚魚腎臟組織，任意取3張切片隨機選10個視野，每項指標(biāo)采用 IPP
圖像分析軟件測量相關(guān)數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長特點

大鱗副泥鰍仔魚、稚魚呈線性生長，擬合方程分別為：y=1.047x+0.356(R2=0.99)(圖1)。

圖1 大鱗副泥鰍仔稚魚全長變化

2.2 前腎發(fā)育特征

顯微觀察發(fā)現(xiàn)2日齡仔魚腎臟由一條直達軀干后部的原始腎管構(gòu)成，其管壁細(xì)胞排列疏松，背側(cè)有大血管(圖版I-1)。4日齡，前腎小管徑較小(長徑：(39.1±7.1) μm；短徑：(28.3±3.1) μm)，管壁為立方上皮，細(xì)胞核位于細(xì)胞中心，核呈橢圓形，胞質(zhì)呈淡粉紅色，弱嗜酸性，細(xì)胞高度為(7.5±1.1)μm，腹膜開始出現(xiàn)黑色素細(xì)胞(圖版I-2)。5日齡，前腎小管上皮為單層立方上皮，細(xì)胞高度為(10.4±1.9) μm，細(xì)胞間界限不清(圖版I-3)。7日齡，腎間質(zhì)大幅增多，可見紅細(xì)胞大量分裂，腎間質(zhì)與前腎小管間存在空白區(qū)(圖版I-5)。12日齡，前腎小管繼續(xù)分化，凹形的管狀結(jié)構(gòu)，管腔增大(圖版I-6)。20日齡前腎小管繼續(xù)分化，其管腔增大，管腔上皮細(xì)胞排列較緊密，細(xì)胞高度為(11.09±3.1) μm。

2.3 中腎發(fā)育特征

4日齡，中腎導(dǎo)管壁組織橫切面觀察，一般由 6～7 個立方狀細(xì)胞圍成，周圍可見扁平或圓形的嗜堿性細(xì)胞(圖版II-1)。5日齡，中腎導(dǎo)管細(xì)胞質(zhì)嗜酸性略有增強與血管相鄰，外圍見造血干細(xì)胞團及原紅細(xì)胞(圖版II-2)。7日齡，緊鄰中腎導(dǎo)管壁及腎間質(zhì)中可見細(xì)胞質(zhì)嗜堿性的未分化細(xì)胞團以及造血干細(xì)胞(圖版II-3)。12日齡，中腎腎小管分布密度為(497.2±34.1)個/mm2，其中可見一種腎小管呈橢圓形或長條形(長徑：(32.2±2.1) μm；短徑：(13.2±1.7) μm)，管腔小，腔上皮聯(lián)系疏松，胞核大而圓，細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性，細(xì)胞高度為(9.76±2.1) μm)(圖II-4)。15日齡中腎結(jié)構(gòu)較松散，腹膜分化完全，將體腎與腹腔分開，出現(xiàn)腎單位，腎小球(長徑：(87.6±8.7) μm；短徑：(80.2±7.3) μm)形成由間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成網(wǎng)眼狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)眼內(nèi)可見紅細(xì)胞，腎臟腹側(cè)可見大血管(圖II-5)。20日齡，中腎腹側(cè)血管(靜脈)充滿血液，近曲小管(長徑：(29.3±3.5) μm；短徑：(23.1±2.7 μm)和遠曲小管(長徑：(34.1±3.8) μm；短徑：(28.2±2.6) μm)分化形成，數(shù)量大幅增多，腎小管密度為(516.4±63.2)個/mm2(圖II，6)。30日齡中腎近曲小管和遠曲小管數(shù)量增多，腎小管密度為(607.4±48.1)個/mm2，中腎小管管壁多為單層柱狀上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞高度為(11.49±3.2) μm)，排列十分緊密，界限不清，管腔面有明顯刷狀緣。細(xì)胞核大且著色深，呈圓形或者橢圓形，多位于細(xì)胞中位(圖II-7)。50日齡腎臟結(jié)構(gòu)致密，中腎擬淋巴組織發(fā)育也趨于成熟，腎小管密度為(709.3±89.4)個/mm2，腎小管上皮細(xì)胞高度可達(12.39±2.8) μm)，近曲小管(長徑：(26.3±3.6) μm；短徑：(20.1±2.8) μm)、遠曲小管(長徑：(32.1±3.8) μm；短徑：(25.2±2.7) μm)，以及集合管(長徑：(47.1±6.8) μm；短徑：(23.3±3.8) μm)等腎小管結(jié)構(gòu)趨于完善(圖II-8,9)。

3 討論

腎臟作為硬骨魚類的重要器官之一，有著排出代謝廢物、調(diào)節(jié)機體水鹽代謝和酸堿平衡、分泌生物活性物質(zhì)功能。與多數(shù)硬骨魚類類似，大鱗副泥鰍腎臟的發(fā)育大體上分兩個階段：前腎期和中腎期。魚類胚胎期的泌尿器官為前腎亦稱原腎[5]。大鱗副泥鰍在2日齡即可觀察到前腎由一對直的沿著脊椎直抵軀干后部的原腎小管組成。它是由緊接在前腎后面的一系列生腎節(jié)發(fā)育而成的管狀體，位于體腔背壁，腹面覆蓋著間皮。馬克勤等[2]研究表明仔魚在發(fā)育初期其代謝廢物主要經(jīng)前腎管排出體外，而前腎周圍未見血管球，故濾尿效能低。發(fā)育至4日齡可見造血干細(xì)胞，之后造血干細(xì)胞分化為各種血細(xì)胞，血細(xì)胞分布在體腎間質(zhì)成為擬淋巴組織。這與南方鲇[4]、大黃魚(Larimichthyscrocea)[13]及鯉(Cyprinuscarpio)[14]等類似。相較于貝氏高原鰍[6]，大鱗副泥鰍中腎發(fā)育較快。這可能由于貝氏高原鰍生存溫度要高，低溫環(huán)境下，動物的新陳代謝緩慢，各器官的發(fā)育速度自然就慢。在發(fā)育早期，大鱗副泥鰍腎臟不管是前腎還是中腎，都存在這類腎小管：腎小管管壁內(nèi)有刷狀緣，壁細(xì)胞由弱嗜酸性立方上皮及細(xì)胞核扁平端位的強嗜酸性細(xì)胞兩類間隔分布，為單層柱狀上皮。部分此類腎小管管壁轉(zhuǎn)變?yōu)橛袃?nèi)層細(xì)胞核圓而深染細(xì)胞界限不清的細(xì)胞和外層核圓而淡染、細(xì)胞質(zhì)弱嗜堿性的立方上皮的假復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，這類腎小管在成魚體腎中亦可見到[15-17]。

大鱗副泥鰍長期生活在靜水的底層，常出沒于池塘、溝渠以及水田底部等低氧的環(huán)境下，而不同于其他鰍科魚類喜于生活在含氧豐富的流水的環(huán)境中[10]。從組織切片來看，大鱗副泥鰍的腎小體較小，但其腎小管數(shù)目較多，腎小管分布有顯著刷狀緣。有研究表明在缺水環(huán)境中，腎小管重吸收水分的能力會變強[18]。發(fā)達的刷狀緣，表明其對濾出的蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖以及其他大分子物質(zhì)的重吸收作用較強。林浩然[19]認(rèn)為其可能參與等滲的Na+的主動重吸收，在維持滲透壓及水鹽平衡中發(fā)揮重要作用。Endo等[20]研究表明，Na+從管腔到上皮細(xì)胞的主動運輸可能由于是淡水魚類對從高滲型尿液中吸收Na+的適應(yīng)。從近曲小管到收集管，刷狀緣的發(fā)達程度逐漸減弱，可知近曲小管可能是原尿中的有機大分子營養(yǎng)物質(zhì)的重要的吸收場所[21]。大鱗副泥鰍腎在發(fā)育過程中，腎臟各部分對糖類等有機分子和離子重吸收的組織結(jié)構(gòu)特點，是維持其體內(nèi)高滲透壓的組織基礎(chǔ)，使得大鱗副泥鰍可以離開水，耐低氧，其腎臟的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育是與生態(tài)環(huán)境長期適應(yīng)的結(jié)果。

圖版I 大鱗副泥鰍前腎發(fā)育組織學(xué)觀察 Plate I Histological observation on head- kidney development of P.dabryanus 1.2日齡仔魚(縱切)；2.4日齡仔魚(縱切)； 3.3日齡仔魚(縱切)； 4.7日齡稚魚(縱切)； 5.12日齡稚魚(橫切)； 6.20日齡稚魚(橫切)； H.E染色。ES食道；IN腸道；Me黑色素細(xì)胞；PD前腎小管； RBC紅細(xì)胞； RT腎小管；V靜脈

圖版II 大鱗副泥鰍中腎發(fā)育組織學(xué)觀察 Plate II Histological observation on mid- kidney development of P.dabryanus 1.4日齡仔魚(橫切)；2.5日齡仔魚(橫切)； 3.7日齡稚魚(縱切)； 4.12日齡稚魚(縱切)；5.15日齡稚魚(縱切)； 6.20日齡稚魚(橫切)； 7.30日齡稚魚(橫切)；8.50日齡稚魚(橫切)；9.50日齡稚魚(橫切)，H.E染色。CT集合管；DS遠曲小管； IN 腸道；LT 擬淋巴細(xì)胞； Me 黑色素細(xì)胞；MD：中腎導(dǎo)管 Pe腹膜；PS 近曲小管；RBC 紅細(xì)胞；RC 腎小體；RT 腎小管；S 血竇； SC分泌細(xì)胞；UC未分化細(xì)胞；V 靜脈