馬連杰， 張 慧，馮牧野，盧文才，廖敦秀

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，重慶 401329)

鏈格孢菌(Alternariaspp.)屬子囊菌Ascomycota座囊菌綱Dothideomycetes格孢腔菌目Pleosporales格孢腔菌科Pleosporaceae鏈格孢屬Alternaria[1],是一類適應(yīng)性強(qiáng)、極為常見的真菌，美國農(nóng)業(yè)部真菌寄主索引(USDA Fungal Host Index)中，記錄了4 000多種Alternarial /Host的關(guān)系，依據(jù)寄主的數(shù)目，鏈格孢屬位于近2 000種真菌屬中的第10位[2]。全世界已描述的約500個(gè)鏈格孢種級(jí)分類單位中，95%以上兼性寄生在植物上，引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害[3]，如馬鈴薯早疫病、梨黑斑病、煙草赤星病(褐斑病)等。鏈格孢真菌屬級(jí)特征明顯，但種級(jí)特征變異較大，易于鑒定到屬但難于鑒定到種，特別是利用小孢子形態(tài)鑒定到種更加困難，因?yàn)樵谌斯づ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)易受環(huán)境影響出現(xiàn)趨同現(xiàn)象[4-5]。研究表明，利用接近自然狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)相對(duì)貧乏的馬鈴薯-胡蘿卜-瓊脂( potato carrot agar，PCA) 人工培養(yǎng)基，加上光/暗交替等培養(yǎng)條件，能夠根據(jù)菌落特征、產(chǎn)孢表型及分生孢子形態(tài)等綜合鑒定不同小孢子種在形態(tài)上的差異[6]。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)和DNA序列分析技術(shù)逐漸應(yīng)用于鏈格孢屬真菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究中。Hong等[7]將IGS-RFLP分析用于鏈格孢的分類研究，用11種限制性內(nèi)切酶對(duì)5個(gè)鏈格孢種進(jìn)行IGS-RFLP分析，結(jié)果可以將大孢子鏈格孢和小孢子鏈格孢明確區(qū)分開。王洪凱等[5]、Adachi等[8]利用ITS序列，Peever等[9]、岳海梅等[10]利用endoPG基因序列，曲文文等[11]在利用endoPG序列的基礎(chǔ)上結(jié)合OPA2-1、OPA1-3隨機(jī)區(qū)段序列對(duì)鏈格孢的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究，嚴(yán)進(jìn)等[12]利用ITS及gpd序列對(duì)河北和山東鴨梨果實(shí)上鏈格孢菌進(jìn)行了鑒定。

目前國內(nèi)外針對(duì)蠶豆鏈格孢病害的研究較少，重慶地區(qū)更無此類研究。為此，筆者對(duì)分離自蠶豆葉部病斑上的2株具有典型孢子形態(tài)特征的鏈格孢屬真菌DJHB-2和DJHB-3開展形態(tài)學(xué)觀察、系統(tǒng)發(fā)育分析和生物學(xué)特性研究，以期為重慶蠶豆鏈格孢病害研究提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料病原分離材料于2017年3—4月采自重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色作物所永川區(qū)實(shí)驗(yàn)基地和墊江縣沙坪鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)基地蠶豆大面積種植區(qū)，從蠶豆葉病部組織分離到鏈格孢菌株16株，選取其中孢子形態(tài)不同、具有典型特征的代表性菌株2株(DJHB-2和DJHB-3)展開研究。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌形態(tài)鑒定。將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃下培養(yǎng)，7 d后觀察菌落顏色、形狀。將長(zhǎng)滿菌絲的菌餅接種至PCA產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，待產(chǎn)生孢子后，在40倍顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形態(tài)。

1.2.2病原菌的分子鑒定。用CTAB法提取基因組DNA，采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和EF1-728F(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)；EF1-986R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物合成及測(cè)序由北京六合華大基因科技有限公司完成。50 μL PCR擴(kuò)增體系：2×TaqMasterMix 25 μL、10 μmol/L上下游引物各l μL、DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件(ITS)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)條件(EF1)：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物直接送至測(cè)序公司測(cè)序，所得序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA6.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3菌株致病性測(cè)定。采用離體葉片接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。選取純化菌株DJHB-2和DJHB-3在PDA平板上培養(yǎng)活化，待菌絲鋪滿培養(yǎng)皿后，用滅菌的打孔器取1 cm菌餅備用。蠶豆葉片經(jīng)0.5%次氯酸鈉消毒后，晾干，取無菌培養(yǎng)皿，鋪上以無菌水浸濕的濾紙，將菌餅接種至蠶豆葉片上，同時(shí)以無菌PDA培養(yǎng)基圓片為對(duì)照。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后，觀察發(fā)病情況。

1.2.4溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將菌餅(直徑1 cm)接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃共8種溫度條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)6次，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.5pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)配為2～11(每1為一個(gè)梯度)，接入菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)6次，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析及制圖采用Excel 2010和SPSS 22.0，利用單因素方差分析法分析各組數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1病原菌的培養(yǎng)性狀和菌落形態(tài)菌株DJHB-2，平板菌落呈棉絮狀，初期白色，后期發(fā)展為橄欖色或墨綠色，菌落邊緣白色，通常不產(chǎn)生擴(kuò)散色素。培養(yǎng)7～10 d后菌落直徑達(dá)70 mm以上。在PCA平板上，20～25 ℃下培養(yǎng)5～7 d后，可產(chǎn)生5～12個(gè)孢子組成的孢子鏈，分子鏈多有分枝。分生孢子卵形、闊倒棒狀、倒梨形或近橢圓形，具3～8個(gè)橫隔膜和0～3個(gè)斜縱隔膜，分隔處略溢縮，短喙柱狀或錐狀，黃褐色(圖A～B)，同時(shí)參照張?zhí)煊頪4]的方法初步鑒定為鏈格孢菌A.alternata。

菌株DJHB-3在PDA平板上呈羊毛狀，菌落淺橄欖或灰橄欖色，菌落邊緣白色，不產(chǎn)生擴(kuò)散色素。培養(yǎng)7～10 d后菌落直徑50～70 mm。在PCA平板上，20～25 ℃培養(yǎng)5～7 d，可產(chǎn)生6～12個(gè)分生孢子組成的孢子鏈，孢子鏈不分枝或罕見分枝。分生孢子卵形，闊倒棒狀，褐色，具1～4個(gè)橫隔膜，1～3個(gè)縱斜隔膜，分隔外略溢縮，大多分生孢子具短喙(圖C～D)，同時(shí)參照張?zhí)煊頪4]的方法初步鑒定為細(xì)極鏈格孢菌A.tenuissima。

2.2DNA系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育。鏈格孢菌株DJHB-2和DJHB-3的ITS序列約540 bp。由圖2可知，DJHB-2與Alternariaalternata(KT192214.1)聚在一起，DJHB-3與其他鏈格孢種聚在一起。

2.2.2基于EF-1α序列的系統(tǒng)發(fā)育。鏈格孢菌株DJHB-2和DJHB-3的ITS序列約250 bp。由圖3可知，待測(cè)菌株EF-1α基因序列與Alternariatenuissima(LC136865.1)、Alternariaalternata(LC132712.1)和Alternariagaisen(KC584667.1)聚在同一個(gè)分支上，可見EF-1α基因序列在種的區(qū)分上不強(qiáng)。

注:A.DJHB-2菌株在PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d后的菌落；B.DJHB-2菌株在PCA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)7 d后在40倍顯微鏡下觀測(cè)的菌株分生孢子；C.DJHB-3在PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d后的菌落，D: DJHB-3在PCA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后的分生孢子Note:A.Colony of DJHB-2 on PDA after 7 days at 28 ℃;B.Conidia of DJHB-2 on PCA after 7 days at 28 ℃;C.Colony of DJHB-3 on PDA after 7 days at 28 ℃;D.Conidia of DJHB-3 on PCA after 7 days at 28 ℃圖1 DJHB-2和DJHB-3平板菌落和孢子形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of colonies and spores of DJHB-2 and DJHB-3 on plates

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequence

2.3致病性鑒定室內(nèi)葉部離體接種鏈格孢菌株DJHB-2和DJHB-3的結(jié)果見圖4。由圖4可知DJHB-2和DJHB-3 2株鏈格孢菌株均能引起蠶豆葉部病害，病斑呈不規(guī)則黑色。DJHB-2病斑大且更明顯。

2.4生物學(xué)特性分析

2.4.1不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。由圖5可知，溫度對(duì)此2株菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的影響，在不同溫度下DJHB -2 和DJHB-3 2種病原菌菌絲生長(zhǎng)隨溫度變化趨勢(shì)基本相同，菌株在5～35 ℃均能生長(zhǎng)，適宜菌絲生長(zhǎng)的溫度為25～30 ℃，最適菌絲生長(zhǎng)溫度為28 ℃，在5～25 ℃菌落直徑隨溫度升高而升高，尤其在20～28 ℃，菌落生長(zhǎng)迅速，28 ℃達(dá)到最大，之后隨溫度升高而升高，35 ℃后菌落生長(zhǎng)均受到抑制。

圖3 基于EF-1α構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on EF-1α sequence

注：A.DJHB-2侵染蠶豆離體葉片；B.對(duì)照；C.DJHB-3侵染蠶豆離體葉片Note:A.Isolated Vicia fabu leaves infected by DJHB-2;B.CK;C.Isolated Vicia fabu leaves infected by DJHB-3圖4 菌株DJHB-2和DJHB-3在蠶豆離體葉片上致病性鑒定Fig.4 Pathogenicity of strains DJHB-2 and DJHB-3 on isolated leaves of Vicia faba

圖5 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different temperatures on mycelial growth

2.4.2不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。由圖6可知，2個(gè)菌株在pH為2～11時(shí)均能正常生長(zhǎng)，pH對(duì)菌株DJHB-2和DJHB-3菌絲生長(zhǎng)無明顯影響。適宜菌絲生長(zhǎng)的pH為7～10。

3 結(jié)論與討論

重慶地區(qū)地處四川盆地東南緣，四面臨山，冬季寡照，多雨多霧，是我國冬季日照時(shí)間最短的地區(qū)[13]。這種特殊的生態(tài)條件使蠶豆成為重慶市重要的冷季作物，其種植面積僅次于油菜，在重慶市種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中起著重要作用。綜合孢子形態(tài)和分子鑒定結(jié)果，該試驗(yàn)將蠶豆葉片上2株具有典型孢子形態(tài)的鏈格孢菌株鑒定為鏈格孢菌(DJHB-2)和細(xì)極鏈格孢菌(DJHB-3)2個(gè)種。從系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果看，ITS序列對(duì)這2個(gè)菌種有一定的區(qū)分性，EF-1α序列對(duì)這2個(gè)菌株區(qū)分性不佳。2株菌對(duì)溫度較敏感，最適溫度為28 ℃，pH適應(yīng)性強(qiáng)，在pH 2～11時(shí)均能生長(zhǎng)。但該試驗(yàn)還有一定不足，未對(duì)采集到的全部鏈格孢菌株進(jìn)行測(cè)序分析。后續(xù)試驗(yàn)在條件允許情況下將增加采樣點(diǎn)，加大樣本量，對(duì)重慶地區(qū)蠶豆鏈格孢菌株在種上進(jìn)行系統(tǒng)分析，為蠶豆鏈格孢病害防治提供參考。

圖6 不同pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different pH on mycelial growth