唐 露，張新全，黃琳凱，張 旭，趙欣欣，聶 剛，許 蕾

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

鴨茅(Dactylisglomerata)又名雞腳草或果園草，隸屬于禾本科(Gramineae)鴨茅屬[1]，原產(chǎn)于歐洲、北非和亞洲溫帶地區(qū)，主要分布于歐亞溫帶和北非，全屬僅一個(gè)種，即鴨茅[2]。鴨茅作為一種優(yōu)良的冷季型牧草，具有葉多高產(chǎn)、耐陰、適應(yīng)性強(qiáng)、適口性好、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，可用于青飼、調(diào)制干草或青貯，是世界四大廣泛分布的禾本科牧草之一，全球每年約生產(chǎn)14 000 t鴨茅種子，占世界溫帶牧草種子的3.3%[3-4]。除此之外，在石漠化治理、退耕還草，建立糧-草、草-草、林-草復(fù)合植被等生態(tài)工程及草地建設(shè)中鴨茅也發(fā)揮著重要作用[5]。

隨著巖溶石漠化治理和南方現(xiàn)代草地畜牧業(yè)推進(jìn)行動(dòng)項(xiàng)目的實(shí)施，鴨茅作為重要的石漠化治理草種，需求量極大，因此選育出質(zhì)優(yōu)、適應(yīng)性強(qiáng)的鴨茅新品種至關(guān)重要。但是，由于鴨茅是多年生異花授粉植物，其遺傳雜合性高，許多重要農(nóng)藝性狀屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳機(jī)理不明，利用常規(guī)育種方法手段難以滿足不同目的定向培育鴨茅新品種的要求。利用常規(guī)育種結(jié)合分子技術(shù)可顯著提高育種效率，縮短育種周期，加快選育進(jìn)程[6-7]。與其他重要農(nóng)作物相比，利用現(xiàn)代先進(jìn)生物技術(shù)進(jìn)行鴨茅遺傳改良雖然起步較晚，但在種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀的基因定位、基因的遺傳轉(zhuǎn)化等方面已取得了一些初步的成就。為此，回顧近年來國內(nèi)外鴨茅分子育種的主要研究進(jìn)展，并對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在鴨茅育種應(yīng)用中存在的主要問題和應(yīng)用前景進(jìn)行討論和展望，以期供鴨茅育種研究者借鑒。

1 鴨茅品種選育現(xiàn)狀

根據(jù)國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV，http://www.upov.int/portal/index.html.en)公布的數(shù)據(jù)，其成員國互認(rèn)的鴨茅登記品種一百多個(gè)，且大多為綜合品種。而我國鴨茅育種工作從20世紀(jì)80年代起步，截至目前登記的國審品種僅有15個(gè)，其中“滇北”、“古藺”、“寶興”、“川東”、“滇中”5個(gè)為野生馴化品種，“安巴”、“草地瓦納”、“德娜塔”、“大使”、“波特”、“皇冠”、“阿索斯”、“英都仕”、“阿魯巴”和“斯巴達(dá)”10個(gè)為引進(jìn)品種，主要在我國西南地區(qū)推廣應(yīng)用。目前鴨茅品種選育方法較單一，主要為常規(guī)育種，利用現(xiàn)有的種質(zhì)資源進(jìn)行簡單評(píng)價(jià)篩選后選育而成[8-9]，而作物上已較為成熟的分子標(biāo)記輔助育種、轉(zhuǎn)基因育種等在牧草上應(yīng)用較少，加快鴨茅分子育種進(jìn)程，豐富鴨茅品種選育方法，還需廣大育種研究者大力推進(jìn)。

2 遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建

2.1 遺傳多樣性研究

遺傳多樣性研究能真實(shí)反映材料在遺傳物質(zhì)上的差異，明確材料間的親緣關(guān)系，避免了在選配雜交親本時(shí)，因遺傳基礎(chǔ)狹窄影響選配效率，從而為鴨茅雜交育種及遺傳改良提供理論依據(jù)。分子標(biāo)記是進(jìn)行遺傳多樣性分析最有效的工具。分子標(biāo)記種類繁多，性能各異，Costa等[10]對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、ISSR(inter-simple sequence repeat)和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)3種標(biāo)記比較研究發(fā)現(xiàn)，AFLP是最適合于指紋鑒定和評(píng)估鴨茅不同基因型間親緣關(guān)系的標(biāo)記。Mao等[11]研究表明，簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)可以檢測到較多遺傳位點(diǎn)，可視為研究鴨茅遺傳多樣性的有效工具。

國內(nèi)外研究表明，來自不同自然居群的鴨茅其遺傳多樣性存在差異，同時(shí)與其倍性也密切相關(guān)。使用SSR和ISSR標(biāo)記并結(jié)合表型對(duì)希臘3個(gè)不同自然居群的72份鴨茅材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析結(jié)果表明，南部的居群材料比北部具有更高的遺傳多樣性[12]。Last等[13]分別從瑞士、挪威和保加利亞3個(gè)區(qū)域的59個(gè)自然或半自然居群中收集到1 861份鴨茅材料，利用SSR標(biāo)記對(duì)其倍性、種群遺傳多樣性及等位基因多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，3個(gè)居群鴨茅材料皆為四倍體，且不同居群間鴨茅遺傳多樣性和稀有等位基因含量都存在明顯差異。倍性方面，Tuna等[14]對(duì)土耳其特雷斯地區(qū)的57個(gè)鴨茅自然居群的倍性和遺傳多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，大部分的鴨茅為四倍體，二倍體居群較少，且四倍體具有更豐富的遺傳多樣性，聚類分析表明，不同自然居群間有明顯的基因交流。彭燕等[15]用AFLP對(duì)國內(nèi)外35份野生鴨茅材料的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，二倍體鴨茅和四倍體材料之間雖然親緣關(guān)系較近，但四倍體遺傳多樣性比二倍體更豐富。萬剛等[16]利用SSR標(biāo)記對(duì)23份鴨茅二倍體、四倍體鴨茅研究亦表明，四倍體較二倍體材料的遺傳多樣性更為豐富。由此可見，四倍體個(gè)體是鴨茅品種選育的優(yōu)良材料，而多倍體則可視為飼料作物選擇中一個(gè)重要的價(jià)值參考因素，以此提高牧草的產(chǎn)量和質(zhì)量。

鴨茅遺傳多樣性與海拔、地理分布、管理強(qiáng)度和生長地狀況等同樣有一定的相關(guān)性。Reeves等[17]用AFLP標(biāo)記研究了法國和意大利的鴨茅居群，發(fā)現(xiàn)生長于不同海拔的鴨茅居群間存在遺傳多樣性。張成林等[18]同樣采用AFLP對(duì)來自中國新疆和吉爾吉斯坦2個(gè)地區(qū)90份鴨茅材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與海拔升高呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與年均溫增加呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與年降水量、經(jīng)緯度沒有顯著的關(guān)系。Sun等[19]對(duì)來自中亞和中國天山及西南3個(gè)不同地理分布的41份鴨茅材料研究發(fā)現(xiàn)，不同地理來源的鴨茅遺傳多樣不同。Jiang等[20]利用起始密碼子靶向多態(tài)性標(biāo)記(start codon targeted polymorphism，SCoT)對(duì)來自7個(gè)不同區(qū)域21個(gè)國家的95份鴨茅材料進(jìn)行遺傳距離和水平研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自中國兩個(gè)區(qū)域的材料相似性最高，95份材料根據(jù)其地理來源被聚為7類，但也有個(gè)別材料在聚類時(shí)出現(xiàn)意外。另有其他學(xué)者用RFLP(restriction fragment length polymorphism)、RAPD等標(biāo)記對(duì)不同區(qū)域的鴨茅自然居群材料的遺傳變異情況分析，各居群間的遺傳多樣性水平存在差異，也存在較高水平的基因交流[21-22]。此外，Boller和Herzog等對(duì)瑞士和挪威的半自然鴨茅居群進(jìn)行遺傳多樣性研究表明，隨著管理強(qiáng)度的減小，導(dǎo)致遺傳位點(diǎn)內(nèi)基因型多樣性下降[23-24]。總而言之，鴨茅的遺傳差異可能受地理生態(tài)環(huán)境、氣候條件影響，也與育種系統(tǒng)和基因交流有一定相關(guān)性，甚至鳥類的遷徙和育種材料的選擇都與其相關(guān)。而適度放牧有助于基因流發(fā)生，也是種群遺傳多樣性維持的重要機(jī)制，為鴨茅屬物種遺傳保護(hù)提供了重要依據(jù)。

2.2 DNA指紋圖譜在品種鑒定中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的植物品種鑒定通過形態(tài)學(xué)及生育期特性結(jié)合的方法進(jìn)行，但易受環(huán)境影響，且存在定義不明確、觀測誤差大等問題。而DNA指紋圖譜是能夠鑒別生物個(gè)體差異的電泳圖譜，直接反映多態(tài)性豐富，有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足[25]。AFLP、SSR、ISSR、RAPD、SRAP、EST-SSR、SCoT等DNA指紋標(biāo)記作為植物品種鑒定最有效的方法，已在多花黑麥草(Loliummultiflorum)[26]、羊草(L.chinensis)[27]、高羊茅(Festucaelata)[28]、老芒麥(Elymussibiricus)[29]等多種禾草上應(yīng)用。迄今為止，有關(guān)鴨茅在指紋圖譜構(gòu)建的報(bào)道，僅見蔣林峰等[30]采用組合引物法，運(yùn)用4對(duì)SSR引物(A01E14、A01k14、B03E14、D02K13)和1個(gè)ScoT標(biāo)記(SCoT23)鑒定我國21個(gè)鴨茅主栽品種，結(jié)果表明，所有的供試鴨茅品種能夠完全區(qū)分開，且隨著引物組合數(shù)量的適當(dāng)增加，其代表DNA水平信息將更加豐富、全面和準(zhǔn)確，具備更強(qiáng)的品種鑒別能力，適于大規(guī)模數(shù)量的鴨茅品種鑒定。鴨茅指紋圖譜構(gòu)建的研究太少，今后還應(yīng)繼續(xù)選擇和增加品種鑒定所需核心引物，以便適時(shí)擴(kuò)充新的有效核心引物數(shù)據(jù)進(jìn)入指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，從而保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

3 遺傳圖譜構(gòu)建及重要性狀定位

植物育種實(shí)踐表明，突破性飼草品種的選育往往取決于重要基因資源的發(fā)掘利用。分子標(biāo)記輔助下的多基因聚合分子育種將是今后突破性飼草選育開拓性研究的領(lǐng)域，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)(marker assisted selection，MAS)為多基因聚合選擇提供了強(qiáng)有力的工具[31]。重要農(nóng)藝性狀QTL(quantitative trait loci)定位分析是分子標(biāo)記輔助選擇育種的基礎(chǔ)，而高密度遺傳圖譜構(gòu)建又是重要農(nóng)藝性狀QTL分析的基礎(chǔ)，在遺傳圖譜的基礎(chǔ)上檢測數(shù)量性狀和分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性，解析復(fù)雜性狀和探究表型變異的遺傳力，尋找主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種[32]。

3.1 遺傳圖譜構(gòu)建

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)目前已構(gòu)建了23余個(gè)牧草品種50余張遺傳連鎖圖譜，涉及豆科苜蓿屬、三葉草屬、百脈根(Lotusccorniculatus)，禾本科羊茅屬、黑麥草屬、鴨茅屬和結(jié)縷草屬等常見草種[33]。有關(guān)鴨茅遺傳圖譜構(gòu)建研究報(bào)道較少，截至目前國內(nèi)外構(gòu)建了4張鴨茅遺傳圖譜(表1)。2011年，Song等[34]首次報(bào)道了同源四倍體鴨茅的SSR連鎖遺傳圖譜，其中父本的遺傳圖譜包含24個(gè)連鎖群，總長度為562 cM，有168個(gè)位點(diǎn)，平均圖距3.3 cM，母本包含26個(gè)連鎖群，總長度為745 cM，有227個(gè)位點(diǎn)，平均圖距為3.3 cM，親本圖譜間同源連鎖群共有7個(gè)。Xie等[35-36]則采用SRAP(sequence-related amplified polymorphism)、SSR兩種標(biāo)記構(gòu)建了世界上首張二倍體鴨茅遺傳圖譜，并隨即采用雙擬測交策略構(gòu)建了包含284個(gè)單株的F1代作圖群體，使用20對(duì)AFLP引物和65對(duì)SSR引物構(gòu)建了另一張同源四倍體鴨茅高密度遺傳圖譜。

表1 已報(bào)道的鴨茅遺傳圖譜Table 1 Genetic maps of orchardgrass

2016年四川農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)道了由2 510個(gè)標(biāo)記構(gòu)建的總長度715.77 cM,平均圖距0.37 cM的高密度四倍體鴨茅遺傳圖譜，其獨(dú)特之處在于采用SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)技術(shù)和HighMap軟件開發(fā)了數(shù)以萬計(jì)的高密度分子標(biāo)簽，最終經(jīng)過分析與篩查將符合要求的SNP標(biāo)記用于圖譜構(gòu)建。該研究結(jié)果極大地推進(jìn)了鴨茅重要農(nóng)藝性狀QTL定位及功能基因挖掘與研究的進(jìn)程[37]。

3.2 重要農(nóng)藝性狀定位

許多重要的農(nóng)藝性狀是由多基因控制的，稱為數(shù)量性狀位，受到多種因素的影響，通過構(gòu)建遺傳連鎖圖譜(genetic linkage map)來對(duì)QTL進(jìn)行定位即連鎖作圖，也稱為QTL作圖[33]。鴨茅中利用分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位、克隆的報(bào)道不多，具體性狀及方法如表2所列。Xie等[36]通過QTL分析在不同年際間共檢測到7個(gè)抽穗期相關(guān)的QTL，各QTL所解釋的表型變異范圍為7.85%～24.19%，且將檢測到的QTL與近緣物種基因組比較證實(shí)，該研究所檢測到的QTL是有效的。隨后，Zhao等[37]同樣通過高密度的SNP遺傳圖譜對(duì)抽穗期及開花期進(jìn)行QTL分析，4個(gè)環(huán)境中共檢測到11個(gè)與目標(biāo)性狀顯著相關(guān)的QTL，貢獻(xiàn)率為8.2%～27%，并找到與抽穗和開花密切相關(guān)的候選基因hd1和vrn1。筆者所在的四川農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草分子育種研究團(tuán)隊(duì)目前也正致力于鴨茅生物量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀如株高、分蘗、葉長等進(jìn)行QTL定位研究，力圖開發(fā)更多與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記?；谶B鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)發(fā)現(xiàn)新等位基因的方法稱為關(guān)聯(lián)分析(association analysis)，亦被稱為LD作圖[42]。Yan等[39]采用EST-SSR和ScoT兩種標(biāo)記對(duì)75份抗銹病程度不一的鴨茅進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并通過關(guān)聯(lián)分析找到了20個(gè)與銹病顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為鴨茅抗銹病分子標(biāo)記輔助育種和關(guān)聯(lián)作圖分析提供了重要信息。同時(shí)Zeng等[40]通過GWAS關(guān)聯(lián)到5 211個(gè)與鴨茅銹病相關(guān)的SNP標(biāo)記，并挖掘到兩個(gè)抗病性候選基因細(xì)胞色素P450及醇溶蛋白基因。Zhao等[41]對(duì)4個(gè)候選基因DgCO1、DgFT1、DgMADS、DgPPD1-like進(jìn)行了抽穗期與多態(tài)性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，其中DgCO1含有最多的顯著性相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)且貢獻(xiàn)率高，可用于今后鴨茅不同開花期品種選育研究。

4 鴨茅分子標(biāo)記開發(fā)及重要功能基因挖掘

4.1 分子標(biāo)記開發(fā)

比起傳統(tǒng)的通過構(gòu)建基因文庫再對(duì)其相關(guān)區(qū)域克隆進(jìn)行Sanger測序開發(fā)分子標(biāo)記，新一代測序NGS(next generation sequencing)的迅速發(fā)展為分子標(biāo)記的開發(fā)帶來新的機(jī)遇，其耗時(shí)少，成本低、準(zhǔn)確性也大大提高。Hirata等[43]從1個(gè)日本鴨茅品種的4個(gè)富含SSR序列的基因組文庫中分離得到969個(gè)SSR克隆序列，用于引物設(shè)計(jì)，經(jīng)驗(yàn)證有676個(gè)SSR標(biāo)記可擴(kuò)增出條帶，其中606個(gè)標(biāo)記顯示出多態(tài)性。為了豐富鴨茅標(biāo)記數(shù)量，提高鴨茅遺傳資源利用率，Bushman等[44]利用雙端測序從鹽、干旱、和冷脅迫處理的鴨茅組織的cDNA 文庫中開發(fā)了許多EST序列 (expressed sequence tags, EST)和1 162個(gè)EST-SSR標(biāo)記，并利用水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)等同源序?qū)ζ溥M(jìn)行注釋。Huang等[45]基于轉(zhuǎn)錄組測序從7 764個(gè)Unigenes里開發(fā)了8 475個(gè)EST-SSR 標(biāo)記，并從75 875個(gè)Unigennes鑒定到669 300個(gè)高質(zhì)量的SNP。李季等[46]從基因組Survey 測序中鑒定出78 984 個(gè)SSR 位點(diǎn)，并開發(fā)出67 216 對(duì)Genomic-SSR引物，經(jīng)驗(yàn)證其擴(kuò)增成功率高、多態(tài)性強(qiáng)且效率高，有望在鴨茅分子育種中發(fā)揮重要作用。

表2 鴨茅重要農(nóng)藝性狀定位Table 2 Mapping of main agronomic traits of Orchardgrass

4.2 重要功能基因挖掘

關(guān)于鴨茅重要功能基因的挖掘主要通過基因探針捕獲、RNA-seq技術(shù)等方式挖掘重要功能基因，相關(guān)報(bào)道如表3所列。Xie[47]通過查詢近緣物種開花基因的保守序列，設(shè)計(jì)基因探針，進(jìn)行鴨茅基因組開花基因序列的捕獲，最終通過序列同源比對(duì)找到了與開花相關(guān)vrn1、vrn3基因同源序列。Huang等[45]通過RNA-seq技術(shù)對(duì)兩份重要的鴨茅資源“寶興”(耐熱)和“01998”(熱敏感)進(jìn)行研究，通過Illumina HiSeq 2000測序分別得到了3 527(寶興)及2 649(01998)個(gè)差異表達(dá)基因，并通qRT-PCR對(duì)隨機(jī)挑選的8個(gè)DEG進(jìn)行了驗(yàn)證，挖掘到大量耐熱相關(guān)的候選基因，并正在對(duì)ZFP、PIP及XTH這3個(gè)候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證研究。Feng等[48]對(duì)鴨茅開花前后6個(gè)不同時(shí)期的RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)春化期間有4 689個(gè)基因表達(dá)明顯增加，3 841個(gè)基因下降，并挖掘到與春化及花芽發(fā)育過程相關(guān)的候選基因CCAAT基因家族，并發(fā)掘相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY,NAC，AP2/EREBP，AUX/IAA，MADS-BOX，ABI3/VP1，bHLH，其中MADS-BOX可能參與春化調(diào)控。Zou等[49]通過分析處理前、5 h水處理及5 h秋水仙素處理的根尖轉(zhuǎn)錄組信息，發(fā)現(xiàn)3 381個(gè)基因在5 h水處理后進(jìn)行了差異表達(dá)，而3 582個(gè)基因在5 h秋水仙素處理后進(jìn)行了差異表達(dá)。比較兩個(gè)處理的轉(zhuǎn)錄組信息，共篩選出2 247個(gè)表達(dá)顯著差異基因，這些基因參與了苯丙素生物合成、苯基丙氨酸代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉蔗糖代謝、細(xì)胞凋亡、化學(xué)致癌等通路。隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)功能基因挖掘的方法將更加便捷快速，但如何在數(shù)以百萬計(jì)的測序結(jié)果中，進(jìn)行高效的生物信息學(xué)分析，篩選到重要的目標(biāo)基因，則還需要不斷地深入探討。

基因挖掘、定位的最終目的是克隆目標(biāo)性狀基因并將其應(yīng)用于育種實(shí)踐。鴨茅基因克隆及表達(dá)分析等工作雖然已經(jīng)起步，但研究內(nèi)容還比較零散，系統(tǒng)性差。 Alexandrova和Conger[50]通過表型克隆的方式，分離克隆了兩個(gè)跟體細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因DGE1和DGE2。董志等[51]通過RT-PCR技術(shù)從鴨茅斑駁病毒(fCMV)總RNA中獲得了外被蛋白(CP)基因，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析證明，CP基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)。季楊[52]通過同源克隆的方式，首次克隆了鴨茅中調(diào)控抗氧化酶(SOD、CAT和POD)的相關(guān)基因。此外，鴨茅基因克隆研究大多關(guān)注于抗逆性基因，相關(guān)研究工作為鴨茅抗逆育種奠定了重要基礎(chǔ)。

表3 已報(bào)道的鴨茅重要功能基因挖掘Table 3 Important functional gene mining of Orchardgrass

5 遺傳轉(zhuǎn)化體系建立及轉(zhuǎn)基因研究

轉(zhuǎn)基因牧草具有許多優(yōu)良性狀，能提高牧草的質(zhì)量，還可增強(qiáng)對(duì)不利因素的抗性，因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)在牧草上的運(yùn)用越來越廣泛。目前，牧草中轉(zhuǎn)基因研究在苜蓿(Medicagosativa)、百脈根、高羊茅、白三葉(Trifoliumrepens)上較為成功，例如，抗蟲害轉(zhuǎn)基因苜蓿、抗禽流感轉(zhuǎn)基因百脈根等都在我國培育成功[53-54]。而鴨茅由于其遺傳背景復(fù)雜，高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系難以構(gòu)建，因此轉(zhuǎn)基因研究報(bào)道較少，相關(guān)研究如表4所列。最早關(guān)于鴨茅遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的報(bào)道見于1972年，Schenk和Hildebrandt[55]將鴨茅葉片沿中軸撕開，橫切成3 mm小段后于SH 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可得到愈傷組織。1982年，Conger等[56]先將 ‘Potomac’鴨茅最內(nèi)部幼嫩葉片誘導(dǎo)3～4周后轉(zhuǎn)入SH繼續(xù)培養(yǎng)得到鴨茅再生植株，然后發(fā)現(xiàn)，使用鴨茅葉肉細(xì)胞培養(yǎng)，可以不產(chǎn)生愈傷而直接發(fā)生體細(xì)胞胚。1984年Gray等[65]提出和建立了鴨茅懸浮細(xì)胞系，并且成功誘導(dǎo)胚性愈傷的形成。在懸浮培養(yǎng)基中利用鴨茅幼嫩葉片培育形成胚狀愈傷組織，這些懸浮液即被用來作為原生質(zhì)體，用于遺傳轉(zhuǎn)化。隨后通過電熱擊法和PEG法，成功將抗潮酶素基因轉(zhuǎn)入該鴨茅原生質(zhì)體系中，經(jīng)過潮霉素選擇培養(yǎng)基篩選和對(duì)轉(zhuǎn)化子Southern雜交鑒定后，由胚形愈傷誘導(dǎo)而成的轉(zhuǎn)基因植株含有潮霉素抗性基因[57-58]。1997年Denchev等[59]通過基因槍法將包含bar和GUS(報(bào)告基因)基因的DNA微彈直接轟擊轉(zhuǎn)入鴨茅葉肉細(xì)胞形成的胚形愈傷組織中，共轉(zhuǎn)化率達(dá)到30%。2000年Lee等[60]通過同樣的方式，首次通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化得到兩個(gè)品種的鴨茅轉(zhuǎn)基因植株，從而改善了以往遺傳轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低的現(xiàn)狀。2001年，他們將BcGR1(谷胱甘肽還原酶)基因轉(zhuǎn)入鴨茅植株中[61]。同年，Nakumar等[62]則利用四倍體鴨茅種子建立了一個(gè)高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將兩個(gè)抗2,4-D基因轉(zhuǎn)入愈傷組織，共轉(zhuǎn)化率達(dá)30%，得到的T0代植株倍性變化極大，30%為四倍體，70%為八倍體。Kim等[63]在2005年將一個(gè)耐熱基因DgP23通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入鴨茅愈傷組織，且將轉(zhuǎn)化而得的植株置于X射線中處理，但得到的轉(zhuǎn)基因植株在表型上與野生型卻沒有任何差異。并在2008年將另一個(gè)耐熱基因DgHsp17.2轉(zhuǎn)入鴨茅，雖然得到的轉(zhuǎn)基因植株在田間及溫室試驗(yàn)與野生型沒有太大差異，但將轉(zhuǎn)基因植株置于致死溫度時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性[64]。Lee[66]2003年開始研究鴨茅品種及各種生長調(diào)節(jié)劑對(duì)構(gòu)建高頻轉(zhuǎn)化體系的影響，并在2006年利用鴨茅種子建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系，繼續(xù)探討農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)中如何提高其遺傳轉(zhuǎn)化率[67]。但之后近10年關(guān)于鴨茅轉(zhuǎn)基因研究均未見報(bào)道，鴨茅作為重要的冷季型禾草，其基因功能分析研究方面幾乎處于剛剛起步的階段，如何完善鴨茅再生及高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，深入重要目標(biāo)基因的功能研究也是筆者所在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草分子育種研究團(tuán)隊(duì)近年來正在全力攻克的一大難題。

表4 已報(bào)道鴨茅轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究Table 4 Transgenic studies in Orchardgrass

6 研究展望

綜上所述，相較于其他重要經(jīng)濟(jì)作物，鴨茅分子育種工作起步較晚，但在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因研究等方面取得了較大的進(jìn)展，可見分子育種技術(shù)對(duì)于加快育種進(jìn)程、提高選擇效率及預(yù)見性方面是可行的，但目前尚存一些問題仍待進(jìn)一步探討。筆者認(rèn)為，就鴨茅的分子育種現(xiàn)狀而言，未來應(yīng)不斷推進(jìn)以下幾方面工作：

1)基因組學(xué)的發(fā)展將為分子育種帶來全新的發(fā)展契機(jī)。由于大多數(shù)牧草是多年生異花授粉植物，其遺傳雜合性高，基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，全基因組測序存在一定難度，目前僅有蒺藜苜蓿(M.truncatula)[68]、紅三葉(Trifoliumpratense)[69]、二穗短柄(Brachypodiumdistachyon)[70]、多年生黑麥草(L.perenne)[71]、日本百脈根(L.japonicus)[72]、柳枝稷(Panicumvirgatum)、狼尾草(Pennisetumalopecuroides)[73]、狗尾草(Setariaitalica)[74]完成全基因組測序。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草分子育種研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)鴨茅的基因組進(jìn)行基本信息調(diào)查之后，隨即開展測序，已完成全部序列測定、拼接及功能注釋，屆時(shí)對(duì)解析鴨茅基因組結(jié)構(gòu)及特征、親緣關(guān)系及遺傳進(jìn)化、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)等的發(fā)展提供海量信息，也可對(duì)其他禾本科牧草育種提供借鑒。

2)分子標(biāo)記輔助選擇育種將顯著提高育種效率。重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位和分子標(biāo)記的開發(fā)大量工作正在實(shí)施，通過連鎖及關(guān)聯(lián)分析等定位抗逆、品種和產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因位點(diǎn),闡明優(yōu)良種質(zhì)資源中攜帶的優(yōu)異等位變異,開發(fā)育種可用的理想分子標(biāo)記,為分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

3)多基因聚合育種為快速選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高抗的綜合品種提供更多可能。過去常用的雜交、回交、復(fù)交等傳統(tǒng)育種手段，過程繁雜緩慢，聚合效果不理想。而植物多基因聚合育種可快速準(zhǔn)確地聚合植物的優(yōu)良性狀，將定位或挖掘的與鴨茅目標(biāo)性狀緊密連鎖地功能分子標(biāo)記或候選基因進(jìn)一步研究后，結(jié)合全基因組選擇及新一代基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas，通過分子標(biāo)記輔助選擇和遺傳轉(zhuǎn)化等多基因聚合育種方法，對(duì)牧草育種進(jìn)行定向設(shè)計(jì)。尤其是CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因組的特異性和精確敲除，且易于操作、成本低、構(gòu)建周期短并且可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因的編輯，在苜蓿、高粱、水稻、玉米已經(jīng)取得突破，相關(guān)成功經(jīng)驗(yàn)可為鴨茅分子聚合育種提供借鑒。