謝德明 陳良 龍小曾

摘要 本文綜述了轉基因雞的研究及應用，并介紹了3種常用的制備方法，包括外源基因受精卵注射、逆轉錄病毒介導轉基因、利用慢病毒載體實現(xiàn)轉基因的介入和導向，以期為轉基因技術的應用提供參考。

關鍵詞 轉基因雞；研究；應用；制備方法

中圖分類號 S831 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）12-0229-02

轉基因技術的研究雖然備受爭議，但是由于其具有廣闊的應用前景，近年來發(fā)展迅速。與哺乳動物相比，禽類具有特殊的生殖系統(tǒng)，因而家禽的轉基因研究相對滯后。影響轉基因家禽研制的關鍵因素在于表達載體的選擇和外源基因的導入方式，這決定了轉基因家禽的孵化率和轉染率。本文對轉基因雞的制備技術作一綜述，對轉基因技術的合理應用具有重要意義。

1 轉基因雞的研究及應用

1.1 輸卵管反應器的研究

利用動物體所具有的生物功能，在其體內(nèi)經(jīng)過生物自身的代謝，能夠獲得目標產(chǎn)物的細胞、組織器官的方法稱之為動物生物反應器法[1-2]。生物反應器類型主要根據(jù)蛋白表達部位不同來劃分，主要有血液、膀胱、唾液腺、乳腺、輸卵管等生物反應器[3]。乳腺和輸卵管兩大生物反應器的廣泛應用受到了研究者們的高度關注。

干擾素、單克隆抗體等藥用蛋白能夠用于治療人類疾病，通過生物反應器工業(yè)化生產(chǎn)的成本昂貴且耗時，加上產(chǎn)量又不高，無法滿足臨床醫(yī)學的需求[4]。起初人們認為乳腺最有希望成為產(chǎn)生某些藥用蛋白的生物反應器[5]，但結果發(fā)現(xiàn)，乳腺作為生物反應器也具有一定的缺陷，如哺乳動物世代間隔時間長，其中的乳蛋白和脂肪生化成分難以證實，重組蛋白的分離提純耗費大且難度較大。而禽類大部分蛋白的糖基化與人類的較為接近，能避免乳腺中出現(xiàn)的許多問題[6]。由此，人類開啟了對轉基因禽類輸卵管反應器的研究，希望能獲得生產(chǎn)人類藥用蛋白的新途徑。

1.2 轉基因雞的應用

1.2.1 改良雞的種質品質，提高產(chǎn)品質量。雞肉營養(yǎng)豐富，蛋白質含量高，維生素含量豐富，雞肉脂肪中含大量不飽和脂肪酸，易于消化吸收，是人類日常肉類食物的重要組成部分。雞作為經(jīng)濟養(yǎng)殖動物在畜牧業(yè)中也最為常見，具有巨大的商業(yè)價值。轉基因雞能夠改良雞的種質品質，提高產(chǎn)品質量。

1.2.2 生產(chǎn)藥用蛋白。轉基因雞作為生物反應器，主流的應用方向是生產(chǎn)藥用蛋白。在利用哺乳動物細胞作為生物反應器表達部分人用藥物蛋白時，常出現(xiàn)宿主細胞死亡率較高的現(xiàn)象，但如果選擇雞細胞作為宿主來表達，則對其正常的機體功能無任何損傷。與他家畜相比，雞具有養(yǎng)殖成本較低、繁殖周期短、便于規(guī)模管理等特點，雞的產(chǎn)蛋數(shù)量多、蛋白含量高，雞蛋內(nèi)部有天然無菌環(huán)境，蛋白分離提純簡單。對生物制藥業(yè)來說，雞輸卵管生物反應器可以作為臨床醫(yī)學藥用蛋白高效生產(chǎn)的理想途徑。在轉基因雞的研究中，Kwon等[7]制備了促紅細胞生成素，Daisuke等[8]制備了粒細胞集落刺激因子，Kyogoku等[9]制備了化腫瘤壞死因子的Fc受體融合蛋白等藥物蛋白。

1.2.3 抗病育種。經(jīng)過不斷發(fā)展，在分子生物學、遺傳生物學等領域和繁殖育種方面，動物轉基因技術的應用越發(fā)成熟和普遍，這皆因轉基因雞能改善雞的遺傳性狀。轉基因雞不僅可以改善雞的機體性能，還可以提高新品種雞的培育速度，提高飼料轉化率，增加蛋雞產(chǎn)蛋量，提升肉雞質量，改變脂肪/肌肉比例等[10]。轉基因雞的成功制備能在一定程度上提高雞對疾病的抵抗力。危害嚴重的雞傳染性疾病不僅給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟損失，而且還會對人類的身體健康造成重大威脅。現(xiàn)如今，利用轉基因技術培育的抗病物種具有諸多優(yōu)點。一是轉基因技術的應用將一些其他物種的抗性基因導入雞的基因組中，不僅能打破物種隔閡，還可以定向誘導培育，大幅縮減繁殖育種時間；二是避免自然交配育種耗時長、篩選單一、獲得目的性狀的概率小等缺點；三是轉基因技術的應用可避免在家禽疾病預防中疫苗的長期使用和濫用，以及給食物帶來安全隱患等缺點。轉基因技術現(xiàn)已是科學研究中常用的手段，為解決動物疾病問題開辟了新途徑。例如，在2011年國外某研究所首次研發(fā)出對禽流感有一定抵抗力的轉基因雞[11]。

1.2.4 用作模型動物。在發(fā)育生物學模式動物中轉基因雞可充當重要角色，這是因為其來源廣泛，取材容易，且可擁有很多常見的、已經(jīng)被科學家成功定位的功能基因。如雞的絲羽[12]、黃皮膚[13]以及雞的巧瑰冠[14]等，通過基因敲除和基因表達等分子生物學技術以及試驗進行驗證，可將其用作研究鳥綱動物的模型動物。

1.3 轉基因雞研究中出現(xiàn)的問題

1.3.1 轉基因雞制作的方法問題。目前，利用實驗動物進行轉基因研究的效率普遍較低，而利用家畜的效率尤其低。加上在轉基因禽類制作技術中，除了利用慢病毒法以外，其余的方法都不夠完善。轉基因雞制備成功的報道較少，其中有些報道僅限于在胚胎中未能出雛，還有的是嵌合體雞。應用前景較好的有慢病毒法、PGCs制作法，但其在操作技術上還有很大的改善空間。

1.3.2 在宿主染色體中轉基因整合的行為問題。目前的外源基因容易導致內(nèi)源性基因破壞、失活或激活處于關閉狀態(tài)，因為在所有的轉基因動物中插入宿主的染色體均是隨機的，還有可能導致插入位點臨近的染色體發(fā)生重排、缺失、重復或易位，其結果往往會導致出現(xiàn)轉基因陽性個體、出雛后不育、胚胎死亡和四肢畸形等異常現(xiàn)象。

2 轉基因雞制備常用方法

2.1 外源基因受精卵注射

外源基因受精卵注射，即通過口吸管連接毛細玻璃針，在體式顯微鏡下向宿主動物受精卵中直接注入外源基因，外源基因通過受精卵分裂過程中的修復機制整合到宿主細胞基因組中，使其繼續(xù)發(fā)育成轉基因動物[15]。生產(chǎn)轉基因動物常用的方法，其一便是外源基因新受精卵原核注射。

通過試驗證明了利用受精卵顯微注射法生產(chǎn)轉基因家禽是可行的，但雞具有特殊的生殖結構和生理特點，當新鮮雞蛋剛排出時雞胚已經(jīng)發(fā)育，因而難以找到受精的原核，因為其一個卵子同時允許多個精子進入，而雞受精卵的顯微注射實際是胞質注射，主要過程是將外源基因注射到胞質中，由于成本較高，一般實驗室不具備相關專業(yè)設備，同時對該技術的操作要求較高，導致這種方法的運用難以推廣。

2.2 逆轉錄病毒介導轉基因

逆轉錄病毒介導法的主要過程：將外源基因重組到逆轉錄病毒載體上；轉染細胞產(chǎn)毒，收集后經(jīng)超離心得到高濃度的病毒顆粒；將病毒液通過顯微注射注入雞的受精卵或胚盤中；通過病毒的作用，把外源基因整合到受精卵或胚盤干細胞基因組中。由于逆轉錄病毒具有強大的侵染能力，故能將外源基因融合導入宿主細胞染色體中，并能避免僅在特定部位注射，從而使該方法成為外源基因轉移的理想途徑[16]。

1986年，Salter等[17]以發(fā)育雞胚的胚盤為注射部位，顯微注入網(wǎng)織內(nèi)皮增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，RE-V），同時注入雞重組白血病病毒（recombinat avian leucosis virus，re-ALV），得到的個體性成熟后繼續(xù)繁育后代，在子代的基因組中檢測到病毒基因組的序列，試驗證明了病毒基因組能與雞基因組發(fā)生融合。繼而在1989年Bosselman等[18]通過向雞胚中注射復制缺陷型病毒（replication defective virus），首次證實了該病毒可以將外源基因整合到雞的生殖細胞中，并且可遺傳給后代。Harvey等[19]以缺陷型ALV為載體，獲得了轉基因雞，通過CMV啟動子驅動具有表達生物活性的β-內(nèi)酰胺酶，在傳至第4代后仍在后代的卵清蛋白和血清中檢測到且其表達水平在不同子代中較接近。簡而言之，諸多成功實例證明了逆轉錄病毒介導法在制備轉基因雞方面前景廣闊。

2.3 利用慢病毒載體實現(xiàn)轉基因的介入和導向

慢病毒載體具有特別的優(yōu)點，即與逆轉錄病毒載體相比，首先其來源于慢病毒，并在此基礎上發(fā)展成為一種基因操作方法。該方法擁有可感染分裂及非分裂期細胞的能力[20]，其他結構類型簡單的病毒所缺乏的正是這項能力，再加上慢病毒載體對廣泛的宿主都有感受性，因而對轉基因操作而言是理想的工具。

剛開始部分研究小組成功獲得轉基因家禽，這主要是利用一些能導致腫瘤的病毒進行相關試驗而得到的。然而在獲得的家禽中有些會出現(xiàn)發(fā)育不表達，并常出現(xiàn)外源基因mRNA及蛋白表達效率偏低現(xiàn)象，導致了在后代中不容易檢測。目前慢病毒載體作為一種新的逆轉錄病毒，其出現(xiàn)改變了這種現(xiàn)狀。2007年，Lillico等成功制備了轉基因雞，在該轉基因雞的輸卵管上皮細胞中能檢測到人源化單克隆抗體ScFv-Fc和重組人IFN-β-1a蛋白。在我國，科研人員經(jīng)過多年的努力，在運用慢病毒載體制備轉基因雞的研究中也取得了顯著的成績，Liu等[21]獲得了輸卵管特異性表達人防御素4轉基因雞，Cao等[22]獲得了輸卵管特異性表達人溶菌酶的轉基因雞。

目前，在轉基因雞的制備中慢病毒載體介導法的應用已經(jīng)非常成熟，并且Jon等[23]成功實現(xiàn)了對禽流感傳播的抑制，正是利用慢病毒載體獲得的小干擾RNAs（siRNAs）證實的。在轉基因雞制備研究中，慢病毒載體的優(yōu)點主要是其具有獨特的靈活性，同時具有巨大的應用價值，并且在該領域占據(jù)了一定位置。

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