于新宇，張媛媛，嵇志紅

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

老年癡呆又稱阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性退變疾病，多發(fā)于65歲以上的老年人，是老年人群癡呆的主要原因.AD的臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性記憶、認(rèn)知功能障礙及行為失常，典型的病理學(xué)表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失及突觸丟失等.抗AD藥物的開發(fā)研究已成為當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個重要課題.中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)(Atractylodismacrocephala)的根莖，為脾經(jīng)之藥，具有健脾益氣、止汗、安胎等功效[1].近年來，白術(shù)的神經(jīng)保護(hù)作用越來越受到人們關(guān)注[2-5]，但白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(Atractylenolide Ⅲ，ATLⅢ)對老年癡呆動物記憶減退的改善作用尚未見報道.本實驗采用行為測試、生化測定及免疫印跡雜交技術(shù)結(jié)合的方法，考查了ATLⅢ對老年癡呆大鼠記憶障礙的改善作用，初步探討了其作用機制，以為白術(shù)在臨床的藥理應(yīng)用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 動物

實驗選用健康成年雄性SD大鼠50只，體重(270±20) g，購于大連醫(yī)科大學(xué)SPF實驗動物中心.整個實驗過程中大鼠自由飲食飲水，于室溫20℃～22℃、12 h光照12 h黑暗條件下飼養(yǎng).

1.2 儀器及試劑

Morris水迷宮(DMS-2型，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；腦立體定位儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；7230分光光度計(上海分析儀器廠).白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(ATLⅢ，上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號：16032203)；乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20160713)；β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42，美國Sigma公司，使用前用滅菌蒸餾水稀釋成10 μg/μL，37℃恒溫箱孵育5 d使其成為寡聚態(tài)的Aβ1-42)[6]；Bcl-2一抗(美國Cell Signaling公司)；小鼠抗β-actin、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物公司)；ECLTM試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；其他試劑為國產(chǎn)分析純.

1.3 動物分組與給藥

大鼠適應(yīng)環(huán)境2 d后隨機分成5組：對照組，模型組，ATLⅢ低、中、高劑量處理組，每組10只.除對照組外，其他4組大鼠雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ1-42建立老年癡呆動物模型；同時模型組灌胃生理鹽水0.5 mL/d，ATL處理組分別灌胃ATLⅢ(0.5，1，2 mg/(kg·d)).對照組雙側(cè)側(cè)腦室注射同體積生理鹽水，同時每天灌胃生理鹽水0.5 mL/d.連續(xù)給藥4周，至行為學(xué)實驗結(jié)束.

1.4 老年癡呆動物模型建立

大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg，麻醉后固定于腦立體定位儀上，去毛、消毒，分離骨膜暴露頭骨.根據(jù)Pasinos和Watsonde的大鼠腦定位圖譜，于雙側(cè)側(cè)腦室(前囟后1.08 mm，旁開2.5 mm，硬膜下3.7 mm)注入Aβ1-4210 μg(1 μL)，留針5 min.各組動物術(shù)后消毒縫合切口皮膚.

1.5 Morris水迷宮實驗

給藥后24～28 d進(jìn)行水迷宮實驗，共歷時5 d.前4 d進(jìn)行定位航行試驗：隱蔽平臺置于東北象限水面下1 cm，每天訓(xùn)練大鼠4次，每次120 s；儀器自動記錄從入水到找到隱蔽平臺并立于其上所需時間(逃避潛伏期)，數(shù)據(jù)取4次均值.第5天進(jìn)行空間探索試驗：撤去平臺，然后在西南象限(原平臺對側(cè)象限)入水點將大鼠面向池壁放入水中，測定大鼠120 s內(nèi)在4個象限的游泳時間，其中東北象限的時間為記憶保持時間，用來判斷動物記憶儲存及提取再現(xiàn)能力.

1.6 AChE活性測定

水迷宮實驗結(jié)束后，將大鼠斷頭取腦、冰上迅速分離海馬，按質(zhì)量體積比1∶9加生理鹽水制成10%海馬勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清按試劑盒說明測定海馬AChE活性.

1.7 Western Blot檢測

將海馬稱重后置于腦蛋白裂解液中，冰上勻漿，4℃冷凍離心機離心(10 000 r/min)10 min.取上清進(jìn)行蛋白定量，蛋白樣品上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移印跡，硝酸纖維素膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Bcl-2一抗室溫過夜孵育，PBST洗膜3次，加二抗，PBST洗膜3次，ECL溶液顯色，曝光、顯影、定影.掃描儀和凝膠成像系統(tǒng)記錄條帶的光密度值.以β-actin條帶光密度值作為內(nèi)參，計算各目標(biāo)蛋白的相對水平(目標(biāo)蛋白條帶光密度值/相應(yīng)β-actin條帶光密度值).

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 ATLⅢ對癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

水迷宮實驗結(jié)果(見表1)表明，在定位航行實驗中，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組逃避潛伏期均呈縮短趨勢，但第3、第4天模型組的逃避潛伏期顯著長于對照組(P<0.01)，而ATLⅢ中、高劑量組的逃避潛伏期顯著短于模型組(P<0.01).空間探索試驗中(見圖1)，模型組大鼠在原平臺象限(東北象限)的停留時間顯著短于對照組(P<0.01)，且與在其他象限的停留時間差異不顯著，而中、高劑量ATLⅢ組在東北象限的停留時間顯著長于模型組(P<0.05，P<0.01).

表1 大鼠在水迷宮中尋找隱匿平臺的潛伏期 s

注：與對照組比，**P<0.01；與模型組比，##P<0.01.

2.2 ATLⅢ對海馬AChE活性的影響

大鼠海馬AChE活性的測定結(jié)果見表2.由表2可見：與對照組比，模型組海馬AChE活性顯著升高(P<0.05)；與模型組比，ATLⅢ中、高劑量組海馬AChE活性顯著降低(P<0.05).

表2 ATLⅢ對海馬AChE活性的影響

2.3 ATLⅢ對海馬Bcl-2基因表達(dá)的影響

Western Blot實驗結(jié)果(見圖2)表明：與對照組比，模型組海馬Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比，ATLⅢ中、高劑量組海馬Bcl-2的表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01).

與對照組比，**P<0.01；與模型組比，#P<0.05，##P<0.01.

3 討論

目前，關(guān)于AD的發(fā)病機制尚不十分清楚，主要涉及Aβ神經(jīng)毒性作用、膽堿能功能障礙、Tau蛋白異常磷酸化以及氧化應(yīng)激損傷等假說.其中Aβ和AChE在AD發(fā)病機制中起著重要作用.Aβ的神經(jīng)毒性已被確認(rèn)為AD等神經(jīng)退行性疾病的早期原因，有資料表明大鼠側(cè)腦室注射Aβ可誘導(dǎo)海馬ROS顯著增多及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，從而導(dǎo)致動物學(xué)習(xí)記憶能力減退[7].

乙酰膽堿(ACh)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛，腦內(nèi)尤其是海馬內(nèi)ACh含量增加可使動物學(xué)習(xí)記憶能力增強，反之可使學(xué)習(xí)記憶能力減退.由于ACh可被AChE水解失活，因而AChE活力高低可作為反映ACh含量亦即學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo).研究表明，沉積的Aβ對膽堿能神經(jīng)元有毒性作用，可使沉積周圍的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，由此導(dǎo)致記憶損傷[8].Aβ與AChE二者之間也有相互作用，Aβ聚集能使AChE活性升高，AChE活性升高又進(jìn)一步促使Aβ聚集，AChE-Aβ復(fù)合物比單純Aβ聚集物的毒性更大，對細(xì)胞的毒害作用更強，促使AD疾病的產(chǎn)生與惡化[9].也有研究指出側(cè)腦室注射Aβ1-42可明顯升高海馬組織AChE活性[10]，增強大腦膽堿能功能的藥物可以改善Aβ沉積引起的學(xué)習(xí)記憶障礙[11].本實驗中，雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ1-42可使大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退，海馬AChE活性顯著升高，應(yīng)用ATLⅢ后海馬AChE活性顯著降低，結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)的報道一致.

AD導(dǎo)致的腦損傷涉及神經(jīng)細(xì)胞凋亡.Bcl-2基因是凋亡相關(guān)蛋白中最重要的凋亡抑制因子，它對正常細(xì)胞的功能和代謝幾乎無影響，但有抑制病理性細(xì)胞凋亡的作用.其抑制凋亡的機制主要是通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放而抑制促凋亡關(guān)鍵酶caspases-3的表達(dá)，也可通過抑制細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化物的形成而阻止氧化應(yīng)激.腦組織Bcl-2基因表達(dá)增加可一定程度增強學(xué)習(xí)記憶能力.本實驗ATLⅢ組大鼠海馬Bcl-2基因表達(dá)顯著增加，說明其增強學(xué)習(xí)記憶能力與上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān).

近年關(guān)于白術(shù)神經(jīng)保護(hù)作用的研究逐漸增多.我們前期的實驗結(jié)果表明，白術(shù)醇提取物可顯著抑制興奮毒性誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[12]，雙白術(shù)內(nèi)酯可顯著改善衰老小鼠的記憶障礙[13].本實驗主要研究了白術(shù)的有效成分之一ATLⅢ對AD大鼠學(xué)習(xí)能力的影響，結(jié)果表明ATLⅢ可顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與抑制海馬AChE活力、上調(diào)海馬Bcl-2基因的表達(dá)有關(guān).結(jié)果提示ATLⅢ對AD所致的認(rèn)知障礙具有潛在的治療作用.