李四維 吳晶晶 張賽文 李恒 陳丹妮 于斌 屈軍樂

(深圳大學(xué)光電工程學(xué)院,光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳 518060)(2018年3月30日收到;2018年5月16日收到修改稿)

1 引 言

在生命科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展的今天,為了進(jìn)一步了解和研究生命體之間的相互作用、疾病的產(chǎn)生機(jī)理,人們迫切需要獲得更加精確的細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)信息.但是,由于光學(xué)衍射極限的存在,常規(guī)的光學(xué)顯微鏡的分辨率只能達(dá)到200 nm左右,難以滿足現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的需要.近年來,單分子定位超分辨熒光顯微技術(shù)的出現(xiàn),如光敏定位顯微術(shù)(photoactivated localization microscopy)[1]、隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy)[2]、熒光光敏定位顯微技術(shù)( fluorescence photoactivation localization microscopy)[3]等,它們克服了衍射極限,達(dá)到20 nm的橫向分辨率和100 nm的軸向分辨率,有力地推動(dòng)了生命科學(xué)的發(fā)展,廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域[4?8].雖然單分子定位超分辨成像系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨成像,但是較低的軸向分辨率仍有待改善.為了克服這一問題,文獻(xiàn)[9,10]在光路中加入柱面鏡,將單分子定位顯微的景深擴(kuò)展到600 nm;Pavani和Piestun[11]在探測光路中引入特殊相位,將點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)變?yōu)殡p螺旋的形式,實(shí)現(xiàn)熒光分子在軸向±2μm范圍內(nèi)的三維定位;Juette等[12]將探測光路分光并引入光程差,通過計(jì)算兩路光的光程差來獲得熒光分子的軸向位置,使成像景深達(dá)到1μm.雖然這些方法顯著地提升了單分子定位超分辨成像系統(tǒng)的成像景深,但對(duì)于厚度約10μm的完整細(xì)胞而言,現(xiàn)有的方法還不能滿足多分子追蹤時(shí)的大景深要求.為了獲取整個(gè)細(xì)胞的信息,傳統(tǒng)方法是對(duì)同一細(xì)胞的不同軸向位置的層面進(jìn)行一系列掃描探測,再由相關(guān)算法將所有層面信息按照軸向位置排序合成,還原出整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的分子信息.但是,在三維掃描的過程中,不同層面的信息會(huì)相互影響,產(chǎn)生背景噪聲和熒光漂白,降低分辨率.一些研究者提出使用變形光柵對(duì)樣品進(jìn)行多層面探測[13?15],但由于變形光柵的能量主要分布在衍射的0級(jí)與±1級(jí),故該方法最多只能對(duì)細(xì)胞內(nèi)九個(gè)不同層面同時(shí)成像,因此,在實(shí)現(xiàn)大的軸向探測范圍的同時(shí)無法保持較高的軸向分辨率.Yu等[16]提出一種達(dá)曼變形光柵(distorted dammann grating,DDG),它通過達(dá)曼編碼的方式將大部分的光強(qiáng)均勻分布在需要的幾個(gè)衍射級(jí)上,有效地提高了傳統(tǒng)變形光柵的高衍射級(jí)效率.但是,達(dá)曼編碼的方式對(duì)單個(gè)周期中相位分布的寬度有著嚴(yán)格的要求,無法適用于空間光調(diào)制器(spatial light modulators,SLM).針對(duì)這一問題,Zhu等[17]提出了一種能夠適用于SLM的多值純相位光柵(multi-value pure-phase grating,MVPPG)編碼方法.在一個(gè)周期中,它由多個(gè)相位值構(gòu)成,每個(gè)相位分布具有相同的寬度,通過選取合適的相位值,可以獲得與達(dá)曼編碼一樣的效果.在此基礎(chǔ)上,我們將MVPPG和DDG的設(shè)計(jì)思路相結(jié)合,提出一種變形多值純相位光柵(distorted multi-value pure-phase grating,DMVPPG),它不僅具有與DDG相同的特性,并且解決了其無法適用于SLM的缺陷,減少了光柵加工的成本與時(shí)間,降低了使用的難度.另外,通過波前編碼技術(shù)將雙螺旋相位引入DMVPPG中,獲得具有復(fù)合功能的全息相位片.這種新型的全息相位片可以將細(xì)胞樣品中不同層面的分子信息以雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(double-helix point spread function,DH-PSF)[18]的形式成像在同一像平面的不同位置,并且相互之間的光強(qiáng)相近.經(jīng)過理論以及數(shù)值模擬證明,在納米分辨多分子追蹤系統(tǒng)中,相比于變形光柵,這種新型全息相位片可以獲得更高的清晰度和更多細(xì)胞層的信息,有效地提高單分子定位顯微鏡的成像深度.

2 原理和方法

2.1 雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)

DH-PSF是一種特殊的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),在其傳播橫截面上,光強(qiáng)分布呈現(xiàn)為兩個(gè)相對(duì)的旁瓣,隨著物體在軸向離焦距離的變化,原本水平方向上的兩個(gè)旁瓣會(huì)發(fā)生旋轉(zhuǎn)和縮放,如圖1所示.而且旋轉(zhuǎn)的角度與離焦距離成正比關(guān)系,如圖2所示.基于這一特性,DH-PSF可以用來對(duì)三維空間中的稀疏粒子進(jìn)行橫向和軸向的高精度定位[19,20].傳統(tǒng)方法獲得DH-PSF的過程較為復(fù)雜,需要尋找位于拉蓋爾高斯(Laguerre-Gauss,LG)模式平面上特定直線上的LG模式,將這些模式進(jìn)行線性疊加得到DH-PSF[21],并對(duì)其相位分布進(jìn)行迭代優(yōu)化[22],來獲得高效率的相位模板.本文中使用一種簡單方法[23]設(shè)計(jì)DH-PSF.,基于渦旋的傳播性質(zhì)和螺旋光的基礎(chǔ)理論[24],把DH-PSF解析為光瞳平面沿直徑方向上的渦旋光的疊加,其數(shù)學(xué)表達(dá)式如下:

式中i2=?1;(x,y)為相位片的光瞳坐標(biāo);(xk,yk)為第k個(gè)螺旋光的相位奇點(diǎn)的坐標(biāo);Rdh為光瞳半徑;Ndh為螺旋光的數(shù)目,當(dāng)Ndh增加時(shí),光強(qiáng)更加集中在兩個(gè)旁瓣上;M為(Ndh?1)/2;d為相鄰的渦旋奇點(diǎn)的距離,當(dāng)d增大時(shí),兩個(gè)旁瓣的相對(duì)距離會(huì)隨之增大.相比于傳統(tǒng)方法,該方法大幅降低了DH-PSF相位片的設(shè)計(jì)難度,并且具有更高的定位精度和效率.

圖1 DH-PSF相位片和DH-PSF在不同軸向位置的光強(qiáng)分布Fig.1.DH-PSF phase mask and DH-PSF at different axial planes.

圖2 DH-PSF兩個(gè)旁瓣旋轉(zhuǎn)角度與z軸位置的關(guān)系曲線Fig.2.The relationship between the two lobes rotation angles of DH-PSF and the position of z axis.

2.2 變形多值純相位光柵

DMVPPG是通過多值相位編碼技術(shù),對(duì)傳統(tǒng)變形光柵[25]進(jìn)行相位編碼.一方面,DMVPPG與傳統(tǒng)的變形光柵一樣,具備菲涅耳波帶片的透鏡作用,在不同衍射級(jí)具有不同焦距的透鏡效應(yīng);另一方面,對(duì)于傳統(tǒng)的變形光柵,入射光能主要分布在低衍射級(jí)上,高衍射級(jí)上的信號(hào)難以被探測,而DMVPPG在需要的幾個(gè)衍射級(jí)上的光強(qiáng)分布趨于一致,從而能夠探測到更高衍射級(jí)的信息.本文設(shè)計(jì)的DMVPPG具有純相位結(jié)構(gòu),相比振幅光柵,其效率大大提高.其透過率函數(shù)可表達(dá)為

式中(x,y)為DMVPPG為入瞳面的坐標(biāo);Λ為x方向上光瞳孔徑中心的光柵周期;

R為DMVPPG的光瞳半徑,n0是聚焦區(qū)域的折射率,K是常數(shù),決定變形光柵不同衍射級(jí)的焦距大小,當(dāng)光柵緊貼透鏡時(shí),K為聚焦透鏡的數(shù)值孔徑,W20為光柵的離焦系數(shù).m為衍射級(jí),其對(duì)應(yīng)的衍射系數(shù)Cm表示如下:

式中,N是一個(gè)周期內(nèi)被劃分的塊數(shù);φn是第n塊的相位分布值它的選取直接決定了衍射級(jí)之間光強(qiáng)分布.因此,通過最優(yōu)化算法[26],可以尋找合適的相位值來使得所需要的β個(gè)衍射級(jí)的光強(qiáng)分布相當(dāng),即|Cm|2=|C0|2.在實(shí)際光柵相位生成中,根據(jù)(3)式計(jì)算得到φn,并生成一個(gè)二值相位光柵,在一個(gè)歸一化的周期內(nèi),其光柵條紋的每個(gè)離散的相位所占寬度為1/N.并引入(1)式中相同的離焦相位ψw,其透過率表達(dá)式如下:

M0為傅里葉級(jí)數(shù)截?cái)嗉?jí),其m級(jí)的衍射系數(shù)Am為

取Tgrating(x,y)的實(shí)數(shù)部分,并將數(shù)值大于0的部分賦值為1,數(shù)值小于0的部分賦值為?1,這樣可以得到一個(gè)黑白相間的光柵相位分布.最后,將φn的值依序賦值到黑和白的相位區(qū)域內(nèi),將原本的二值相位轉(zhuǎn)換為多值相位的形式,如圖3所示.

圖3 變形多值純相位光柵的設(shè)計(jì)方法Fig.3.The design method of DMVPPG.

圖4 多值純相位光柵的相位分布和切面的結(jié)構(gòu) (a)多值純相位光柵的相位分布;(b)多值純相位光柵在切面上的結(jié)構(gòu)Fig.4.Phase distributions of MVPPG and structure in the section:(a)Phase distributions of MVPPG;(b)the structure of MVPPG in the section.

圖5 變形多值純相位光柵的相位分布及其成像原理 (a)一維變形多值純相位光柵的相位分布;(b)一維變形多值純相位光柵成像原理;(c)二維變形多值純相位光柵;(d)二維變形多值純相位光柵成像原理Fig.5.Phase distributions and imaging principle of DMVPPG:(a)The phase distribution of 1×5 DMVPPG;(b)the imaging principle of 1D-DMVPPG;(c)the phase distribution of 5×5 DMVPPG;(d)the imaging principle of 2D-DMVPPG.

當(dāng)DMVPPG透過率函數(shù)中離焦系數(shù)W20=0時(shí),光柵退化為MVPPG.在一個(gè)歸一化周期內(nèi),光柵被等分為N個(gè)部分,每個(gè)部分具有不同的相位值φn,如圖4(a)所示,其切面結(jié)構(gòu)原理圖如圖4(b)所示;當(dāng)W20/=0,MVPPG中加入了離焦相位ψw,其相位分布如圖5(a)所示.相位條紋產(chǎn)生彎曲,在不同衍射級(jí)上引入了不同焦距的透鏡效應(yīng),其m衍射級(jí)對(duì)應(yīng)的焦距這一特性使得樣品內(nèi)不同軸向位置的信息(相鄰的兩個(gè)樣品面的間隔為Δz)從左到右的成像在同一平面,其原理如圖5(b)所示.如果需要獲得更多樣品層的信息,可以簡單地將一個(gè)1×Mx的DMVPPG和一個(gè)1×My的DMVPPG正交重疊,生成一個(gè)Mx×My階的二維DMVPPG,為了保持兩個(gè)相鄰樣品面之間的距離相等,其離焦系數(shù)W20,x/W20,y應(yīng)等于Mx或者1/My,其相位如圖5(c)所示.當(dāng)樣品面位于軸上不同位置時(shí),經(jīng)3×3的DMVPPG和透鏡成像在探測面,其成像位置與物方樣品位置之間的關(guān)系如圖5(d)所示.當(dāng)樣品面與系統(tǒng)的物方焦平面重合時(shí),即Z=0,其成像位于探測面的正中心;當(dāng)樣品面距離系統(tǒng)的物方焦面的距離為?4Δz時(shí),其成像在探測面的左上角.因此,DMVPPG可以不依靠軸向掃描來實(shí)現(xiàn)軸向大范圍的高分辨率三維成像,可以廣泛地應(yīng)用到活細(xì)胞三維顯微成像、納米尺度三維單分子定位及成像等領(lǐng)域.

3 新型全息相位片

新型全息相位片是通過波前編碼技術(shù),將DMVPPG與DH-PSF結(jié)合產(chǎn)生的,其相位分布為

它是由雙螺旋相位片的相位φdh與變形多值純相位光柵的相位φdmvppg線性疊加而成,這種全息相位片可以將不同樣品面的分子信息以雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的形式成像在同一探測面上不同位置,并且它們之間的光強(qiáng)趨于一致.將其放入顯微成像系統(tǒng)中,其工作光路如圖6所示.反射式的SLM位于4f系統(tǒng)的傅里葉面位置,實(shí)驗(yàn)中,全息相位片顯示在SLM的液晶面板上,通過相機(jī)一次曝光,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同深度的分子信息并行成像;根據(jù)光柵參數(shù)的不同,可以對(duì)光學(xué)系統(tǒng)的景深進(jìn)行不同倍率的擴(kuò)展;同時(shí),它兼具雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的性質(zhì),可以對(duì)景深范圍內(nèi)的離散的分子進(jìn)行納米精度的三維定位.因此,新型的全息相位片可以將原有的探測深度延展數(shù)倍,有利于對(duì)完整細(xì)胞中的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維探測,減少多次探測所帶來的誤差,提高了單分子定位的定位精度.

圖6 基于全息相位片的大景深三維熒光顯微成像系統(tǒng)Fig.6.Large depth of field 3D fluorescence microscopy imaging system based on a new type holographic phase mask.

4 數(shù)值模擬與結(jié)果分析

圖7 二維變形多值純光柵、雙螺旋相位片以及全息相位片的相位分布 (a)二維變形多值純光柵的相位分布;(b)雙螺旋相位片的相位分布;(c)全息相位片的相位分布Fig.7.Phase distributions of 2D-DMVPPG,DH-PSF phase mask and the new tape holographic phase mask:(a)The phase distribution of 2D-DMVPPG;(b)the phase distribution of DH-PSF phase mask;(c)the phase distribution of the new tape holographic phase mask.

為了證明這種新型全息相位片可以有效提高單分子定位顯微系統(tǒng)的探測景深,根據(jù)圖6中的光路進(jìn)行數(shù)值模擬.首先,設(shè)計(jì)生成5×5的DMVPPG,如圖7(a)所示,像素?cái)?shù)為600×600,像素尺寸為10μm;單個(gè)周期的劃分塊數(shù)N=4,對(duì)應(yīng)的相位值φn分別為1.1165π,0.7761π,1.8472π和0.7761π;K=0.4841;周期Λ=200μm;x,y方向的離焦系數(shù)分別為W20,x=10λ,W20,y=50λ.接著根據(jù)(1)式生成雙螺旋相位,其像素?cái)?shù)和像素尺寸與DMVPPG相同,如圖7(b)所示,其中Ndh=9,d=0.7Rdh,旋轉(zhuǎn)180°對(duì)應(yīng)的軸向范圍為1.125μm.最后根據(jù)波前編碼技術(shù)將兩者相位結(jié)合,生成新的全息相位片,如圖7(c).將全息模版放置在焦距f=20 cm的4f系統(tǒng)中,在入射波長λ=480 nm條件下根據(jù)系統(tǒng)參數(shù),可以計(jì)算出相鄰衍射級(jí)對(duì)應(yīng)樣品面之間的距離Δz=0.5μm,匹配雙螺旋最佳定位精度的旋轉(zhuǎn)范圍為?40°—40°.

在物方軸上的不同位置,依次模擬點(diǎn)光源來作為細(xì)胞中的分子,兩個(gè)相鄰的點(diǎn)光源距離為0.5μm,經(jīng)4f系統(tǒng)后成像在CCD的探測面上,根據(jù)光源的不同的軸向位置,在焦平面的對(duì)應(yīng)區(qū)域形成雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù),如圖8所示,其中虛線區(qū)域?yàn)閷?duì)應(yīng)雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的放大圖.當(dāng)點(diǎn)光源位于4f系統(tǒng)透鏡的前焦點(diǎn)處,探測面上形成清晰的雙螺旋點(diǎn),位于整個(gè)視場中心,如圖8(a)所示,雙螺旋的兩個(gè)旁瓣保持水平.當(dāng)點(diǎn)光源與前焦點(diǎn)的距離為0.5Δz時(shí),其恰好位于物方相鄰兩個(gè)成像層面的中間位置,因此衍射零級(jí)和衍射+1級(jí)上會(huì)同時(shí)出現(xiàn)光強(qiáng)相等的雙螺旋點(diǎn),它們分別順時(shí)針旋轉(zhuǎn)40°和逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)40°.如圖8(b)所示.當(dāng)光源距離焦點(diǎn)距離?12Δz時(shí),雙螺旋點(diǎn)分別出現(xiàn)在視場的左上角,如圖8(c)所示.通過上面的模擬結(jié)果,可以證明設(shè)計(jì)出的全息相位片能夠達(dá)到理論上的最大擴(kuò)展深度,有效地將系統(tǒng)探測范圍提升到±6μm.相比于傳統(tǒng)的多焦面超分辨單分子定位熒光顯微系統(tǒng),大幅提高了樣品的成像層數(shù),將樣品內(nèi)相鄰的兩個(gè)探測面的間隔縮小到0.5μm,提高了軸向的分辨率.最后,將每個(gè)衍射級(jí)的強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并進(jìn)行歸一化計(jì)算,如圖9所示.可以看出多值相位編碼有效地將光強(qiáng)均勻分布到所需要的25個(gè)衍射級(jí)上,提高了高衍射級(jí)的光強(qiáng)分布.雖然衍射級(jí)之間的光強(qiáng)并沒有達(dá)到理論上的一致,經(jīng)分析可能是由于相位片在構(gòu)成像素?cái)?shù)較少的情況下,隨著離焦因子的增大,DMVPPG的像素化的相位分布會(huì)與理論值存在一定誤差,光強(qiáng)在不同衍射級(jí)上的分布會(huì)受到影響,因而,隨著構(gòu)成光柵的像素?cái)?shù)增加,像素尺寸減少,并選擇合適的離焦因子,光柵的均勻性會(huì)隨之改善.模擬結(jié)果表明這種新型全息相位片可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的多層面上的分子同時(shí)成像,并將系統(tǒng)的普通點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)轉(zhuǎn)換為雙螺旋的形式,通過雙高斯擬合定位算法,可以實(shí)現(xiàn)精度在10 nm的單分子定位,提高了相鄰細(xì)胞面之間離焦的分子的定位精度.如將上述全息相位模板應(yīng)用到單分子定位超分辨熒光顯微中,結(jié)合熒光分子的稀疏激發(fā),可以同時(shí)對(duì)整個(gè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤和定位.

圖8 點(diǎn)光源處于不同軸向位置的成像結(jié)果 (a)新型全息相位片的相位分布;(b)點(diǎn)光源位于z=0.5Δz位置的成像結(jié)果;(c)點(diǎn)光源位于z=?12Δz位置的成像結(jié)果Fig.8.Imaging results of point light sources at different axial positions:(a)The image result as the point source in the z=0;(b)the image result as the point source in the z=0.5Δz;(c)the image result as the pointsource in the z= ?12Δz.

圖9 探測面上不同衍射級(jí)光強(qiáng)分布Fig.9.The intensity distribution of different diffraction orders in the detection plane.

5 總 結(jié)

本文設(shè)計(jì)的新型全息相位片在擴(kuò)展了探測景深的同時(shí)有效地提高了軸向的分辨率,并且將普通的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)轉(zhuǎn)換為雙螺旋的形式,提高了單分子定位的三維定位精度.將這種新型全息相位片通過SLM顯示應(yīng)用到單分子定位顯微鏡中,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)細(xì)胞中多個(gè)分子的追蹤和高精度定位.一方面,多值相位編碼可以使得所需求的衍射級(jí)上的能量分布趨于一致,進(jìn)一步提高了衍射效率,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)變形光柵高衍射級(jí)的信號(hào)光太弱而無法探測的問題;另一方面,它可以有效地通過SLM來實(shí)現(xiàn),省去了光柵加工的成本與時(shí)間.模擬結(jié)果表明:這種方法能夠?qū)⒃镜膯畏肿佣ㄎ伙@微鏡成像深度擴(kuò)大數(shù)倍,并且能量利用率高,擴(kuò)展了單分子定位顯微的景深;同時(shí),為完整細(xì)胞內(nèi)多個(gè)生物分子實(shí)時(shí)變化的觀察和追蹤提供一個(gè)更好的方案,對(duì)研究生物學(xué)中的分子機(jī)制有著重要的意義.