談文輝 朱 勇 熊本華 諶能富 石 敏 李 丹 唐亞軍

(1.重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院，重慶 400716；2.西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

家蠶又名桑蠶、白蠶,是鱗翅目昆蟲(chóng), 曾在中國(guó)傳統(tǒng)政治、經(jīng)濟(jì)和文化中有重要作用。家蠶具有世代周期短、繁殖率高、遺傳背景清楚、后代個(gè)體數(shù)量多、能大量飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，是一種在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)環(huán)境十分敏感的昆蟲(chóng), 也是農(nóng)藥非靶標(biāo)生物的代表物種之一[2]。中國(guó)是世界上最早植桑、養(yǎng)蠶、繅絲織綢的國(guó)家，絲綢紡織在中國(guó)具有悠久的歷史和鮮明的文化特征，同時(shí)該產(chǎn)業(yè)也具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。古時(shí)人們?cè)陨ｐB(yǎng)蠶的主要目的是用來(lái)繅絲織綢，后來(lái)人們也逐漸開(kāi)始利用蠶蛹作為蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一，但那時(shí)并未對(duì)桑蠶的其他資源進(jìn)行深入地發(fā)掘與利用。隨著社會(huì)的發(fā)展和科技的進(jìn)步，家蠶資源逐步被開(kāi)發(fā)利用，包括其食用和藥用價(jià)值逐漸被發(fā)現(xiàn)與利用，不同形態(tài)的家蠶不僅可以食用，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值也極高[3]。所以家蠶作為中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。

三唑類(lèi)殺菌劑是20世紀(jì)70年代以來(lái)推廣應(yīng)用速度較快的一類(lèi)高效、廣譜農(nóng)藥，已廣泛用于糧油及瓜果蔬菜等多種作物的病害防治。人們普遍認(rèn)為殺菌劑不會(huì)像殺蟲(chóng)劑那樣對(duì)家蠶有較大的危害，但是目前中國(guó)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中殺菌劑在實(shí)際使用中比較隨意，桑葉是家蠶的主要飼料，桑園及其周邊農(nóng)田施用化學(xué)農(nóng)藥，易污染桑葉導(dǎo)致家蠶中毒，甚至引起家蠶大量死亡造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，從而對(duì)家蠶也會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響[5-6]。食下葉毒法是生物測(cè)定中最常用的方法之一，國(guó)內(nèi)外已普遍采用，其能全面反映農(nóng)藥對(duì)家蠶的胃毒、觸殺和熏蒸毒性，接近田間農(nóng)藥對(duì)家蠶的實(shí)際危害情況，且該方法程序較為簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好[7]。關(guān)于農(nóng)藥對(duì)家蠶毒性評(píng)價(jià)的研究已有諸多報(bào)道，但所涉及的農(nóng)藥品種大多為殺蟲(chóng)劑和除草劑，殺菌劑是一類(lèi)重要的農(nóng)藥類(lèi)別，其在國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥市場(chǎng)上的比重呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且新的品種也不斷上市。至今，關(guān)于殺菌劑對(duì)家蠶毒性效應(yīng)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的研究還不夠深入，因此，研究和評(píng)價(jià)常用殺菌劑對(duì)家蠶的急性毒性具有重要應(yīng)用價(jià)值[8]。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蠶品種為871(重慶市蠶業(yè)科學(xué)研究院提供)。

飼養(yǎng)條件：專(zhuān)用蠶房，常規(guī)飼養(yǎng)，普通桑葉飼喂。

1.2 主要試劑和儀器

苯醚甲環(huán)唑(有效成分含量40%，購(gòu)自山東省濰坊市濱海經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū))、丙酮、甘草、碘解磷定、腎上線(xiàn)素、阿托品、去離子水等。

電子天平、量筒、燒杯、干濕溫度計(jì)、純水儀等。

1.3 農(nóng)藥添毒處理

將苯醚甲環(huán)唑原液按照一定比例加入丙酮、蒸餾水配置成3000mg/L的母液，裝入瓶中避光保存?zhèn)溆?。家蠶按照常規(guī)方法飼喂至4齡和5齡，選出發(fā)育狀態(tài)一致的用于實(shí)驗(yàn)。在4齡時(shí)期，選擇3個(gè)濃度，即：900mg/L、1200mg/L、1500mg/L，每個(gè)濃度飼養(yǎng)一定數(shù)量的家蠶，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選90頭家蠶。在5齡時(shí)期，選擇600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L，每個(gè)濃度飼養(yǎng)一定數(shù)量的家蠶，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選90頭家蠶。桑葉按照“浸葉法”完全浸入實(shí)驗(yàn)藥液，1min后取出避光晾干后喂蠶，每天飼喂3次，直到出現(xiàn)中毒反應(yīng)就停止飼喂農(nóng)藥,對(duì)照組則用清水代替藥液。

1.4 解毒處理

將解毒藥品配置成如下濃度：碘解磷定(2g/L、2.5g/L)、腎上線(xiàn)素(4mg/L、6mg/L)、阿托品(2mg/L、3mg/L); 將100g甘草加入3L水熬至2L配置為母液，甘草濃度為將母液稀釋一半的濃度。

本試驗(yàn)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，第一階段是農(nóng)藥添毒處理，添毒的方式是“浸葉法”，在家蠶出現(xiàn)中毒癥狀后停止農(nóng)藥添毒處理。第二階段是解毒處理，改為添食解毒藥品浸泡的桑葉飼喂，不同農(nóng)藥添毒處理后的不同解毒藥品和不同解毒濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每種農(nóng)藥添毒處理后設(shè)置對(duì)照為清水處理，3個(gè)重復(fù)。解毒藥品飼喂3次。第三個(gè)階段是正常飼養(yǎng)階段，所有解毒、未解毒及清水對(duì)照處理的區(qū)域均正常飼養(yǎng)，每天飼喂3次，直至上蔟結(jié)繭。

2 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003和DPS 11.50軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。單程方差分析(ANOVA)用于評(píng)估差異團(tuán)體之間。Dunnett的測(cè)試被執(zhí)行與比較對(duì)照組。雙尾P值小于0.05是認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 農(nóng)藥添毒處理

在4齡期間，處理后觀察家蠶死亡現(xiàn)象，死亡率是隨著濃度的增加而增大。顯示中毒癥狀為: 食桑量減少、體軟、反應(yīng)遲鈍、嚴(yán)重者偶有身體扭曲呈“C”或“S”形，吐少量黃液，死后身體僵直。在處理家蠶過(guò)程中我們還發(fā)現(xiàn)了該農(nóng)藥會(huì)嚴(yán)重改變家蠶的眠性，變成三眠蠶，因此在該齡期添加解毒藥品失去了解毒的經(jīng)濟(jì)意義。

在5齡期間，死亡率也是隨著農(nóng)藥濃度的增大而增加，顯示的中毒癥狀和4齡期添農(nóng)藥的現(xiàn)象基本一致(圖1A)。5齡期間，隨著添毒濃度的增加家蠶校正死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(圖1B)；而家蠶的平均重量隨著濃度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖1C)；家蠶的結(jié)繭率和繭層率隨著農(nóng)藥濃度的增加而降低(圖1D、E)；所以隨著濃度的增加家蠶的公斤繭顆粒數(shù)也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖1F)。

死亡率=(死亡家蠶頭數(shù)/供試家蠶頭數(shù))×100%

校正死亡率=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)×100%

公斤繭顆粒數(shù)=1000/家蠶重量平均值

(A)處理后家蠶癥狀：(a)對(duì)照組家蠶蠶繭；(b)4齡期家蠶處理組家蠶蠶繭;(c)4齡期處理組家蠶中毒癥狀;(d)5齡期處理組家蠶中毒癥狀。(B)家蠶校正死亡率變化。(C)家蠶重量平均值變化。(D)家蠶結(jié)繭率變化。(E)家蠶繭層率變化。(F)家蠶公斤繭顆粒數(shù)變化。

圖1苯醚甲環(huán)唑處理后家蠶癥狀

3.2 解毒處理

在5齡蠶添毒表現(xiàn)出中毒癥狀后，進(jìn)行各種解毒藥品解毒分析。

腎上腺素：在600mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，4mg/L的腎上腺素和6mg/L的腎上腺素解毒后死亡率和校正死亡率都降低，并且體重平均值、結(jié)繭率和繭層率都增加。在800mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，4mg/L的腎上腺素和6mg/L的腎上腺素解毒后體重平均值、死亡率和校正死亡率都降低，并且結(jié)繭率和繭層率都增加。1000mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，4mg/L的腎上腺素和6mg/L的腎上腺素解毒后體重平均值都降低，4mg/L的腎上腺素解毒后死亡率、校正死亡率和繭層率都降低而6mg/L的腎上腺素解毒后死亡率、校正死亡率和繭層率則增加，4mg/L的腎上腺素解毒后結(jié)繭率降低而6mg/L的腎上腺素則相反。1200mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，4mg/L的腎上腺素和6mg/L的腎上腺素解毒后死亡率、校正死亡率都降低，4mg/L的腎上腺素和6mg/L的腎上腺素解毒后結(jié)繭率都增加，4mg/L的腎上腺素解毒后體重平均值降低而繭層率增加，但是6mg/L的腎上腺素解毒后這兩個(gè)指標(biāo)則是相反的(圖2A、2B)。

硫酸阿托品：在600mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，2mg/L的硫酸阿托品和3mg/L的硫酸阿托品解毒后死亡率和校正死亡率都降低，并且體重平均值、結(jié)繭率和繭層率都增加(圖2C、2D)。

碘解磷定：在5齡蠶添毒表現(xiàn)出中毒癥狀后，我們開(kāi)始解毒處理。在600mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，2g/L的碘解磷定和2.5g/L的碘解磷定解毒后體重平均值都增加，2g/L的碘解磷定解毒后死亡率、校正死亡率、結(jié)繭率和繭層率都降低，但是2.5g/L的碘解磷定解毒后死亡率、校正死亡率、結(jié)繭率和繭層率都都增加。在800mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，2g/L的碘解磷定和2.5g/L的碘解磷定解毒后體重平均值、死亡率和校正死亡率都增加，2g/L的碘解磷定解毒后繭層率降低而2.5g/L的碘解磷定解毒后繭層率則增加，2g/L的碘解磷定解毒后結(jié)繭率增加，而2.5g/L的碘解磷定解毒后繭層率則降低；1000mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，2g/L的碘解磷定和2.5g/L的碘解磷定解毒后體重平均值和繭層率都降低，而死亡率和校正死亡率都增加，2g/L的碘解磷定解毒后結(jié)繭率增加而2.5g/L的碘解磷定則相反。1200mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，2g/L的碘解磷定解毒后體重平均值、結(jié)繭率都增加，而死亡率、校正死亡率繭層率都降低(圖2E、2F)。

甘草：在600mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，濃度1的甘草和濃度2的甘草解毒后體重平均值、結(jié)繭率都增加，濃度1的甘草和濃度2的甘草解毒后死亡率、校正死亡率、和繭層率都降低，濃度1的甘草解毒后繭層率增加而濃度2的甘草則相反。在800mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，濃度1的甘草和濃度2的甘草解毒后體重平均值、結(jié)繭率和繭層率都增加，濃度1的甘草解毒后死亡率、校正死亡率都降低，而濃度2的甘草解毒后則相反。在1000mg/L的農(nóng)藥添毒處理后，濃度1的甘草和濃度2的甘草解毒后體重平均值都增加，濃度1的甘草解毒后死亡率增加，校正死亡率、結(jié)繭率和繭層率都降低，而濃度2的甘草解毒后則相反(圖2G、2H)。

(A)腎上腺素4mg/L解毒后各項(xiàng)指標(biāo)；(B)腎上腺素6mg/L解毒后各項(xiàng)指標(biāo)；(C)硫酸阿托品2mg/L解毒后各項(xiàng)指標(biāo);(D)硫酸阿托品3mg/L解毒后各項(xiàng)指標(biāo);(E)碘解磷定2mg/L解毒后各項(xiàng)指標(biāo)；(F)硫酸阿托品2.5mg/L解毒后各項(xiàng)指標(biāo)；(G)甘草濃度1解毒后癥狀；(H)甘草濃度2解毒后各項(xiàng)指標(biāo)。

圖2解毒處理后家蠶各項(xiàng)指標(biāo)圖

4 討論

不同殺菌劑品種對(duì)家蠶的毒性大小、家蠶的中毒癥狀以及農(nóng)藥對(duì)家蠶的風(fēng)險(xiǎn)性差異，苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥對(duì)家蠶的毒性高，危險(xiǎn)性較大[9]，與本研究結(jié)果基本一致。因此，在桑園或臨近桑園的農(nóng)田，應(yīng)避免使用苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥，或在使用這些農(nóng)藥時(shí)應(yīng)避開(kāi)桑葉采集。家蠶幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育狀況、產(chǎn)繭量和繭質(zhì)等經(jīng)濟(jì)指標(biāo)能直觀反映出解毒劑對(duì)家蠶農(nóng)藥中毒的解毒效果[10]。

在4齡期間處理家蠶過(guò)程中我們還發(fā)現(xiàn)了該農(nóng)藥會(huì)改變家蠶的眠性變成三眠蠶，這個(gè)與莊大恒等[11]人的研究一致。在該齡期，中毒后添加解毒藥品基本不會(huì)達(dá)到解毒作用。

在5齡期間，從體重變化來(lái)看，600mg/L濃度的農(nóng)藥處理后，不同的解毒藥品都有明顯解毒效果；從死亡率變化來(lái)看，1200mg/L濃度的農(nóng)藥處理后，不同的解毒藥品都得到明顯解毒效果，死亡率都有明顯的下降；從結(jié)繭率變化來(lái)看，1200mg/L濃度的農(nóng)藥處理后，不同的解毒藥品都有明顯解毒效果，結(jié)繭率都有明顯的提升。因此，從以上解毒效果來(lái)看，1200mg/L的苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥中毒后解毒效果比較明顯，所有解毒藥品中硫酸阿托品解毒的各項(xiàng)指標(biāo)效果最顯著，因此硫酸阿托品對(duì)苯醚甲環(huán)唑的解毒效果最佳。