徐 兵，王夏斌

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

鯽魚（Carassius auratus）是我國一種重要的傳統(tǒng)淡水魚類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)領域占有一席之地.我國絕大部分地區(qū)都有鯽魚的大規(guī)模養(yǎng)殖，但主要分布在東部、中部和南部地區(qū)［1-2］.正確合理地防治細菌性魚病是提高漁業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營效益的必要措施.國內王艷萍［3］等人利用實驗室的5株標準菌株論證了該方法的可行性.黃文明［4］等從發(fā)病的胭脂魚病變部位成功分離獲得兩株細菌，利用16S rRNA基因序列分析手段成功鑒定得到了兩種致病菌.而目前國內尚未有將這一技術運用到水產(chǎn)防治檢測方面的報道，本文通過16S rRNA基因技術鑒定鯽魚病原細菌來進一步證實16S rRNA基因序列分析技術在臨床非典型細菌鑒定方面的應用價值.

1 材料與方法

1.1 試驗原料和試劑

試驗原料：常熟沙家浜水產(chǎn)養(yǎng)殖場的致病鯽魚

試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、瓊脂糖、TAE緩沖液、PCR試劑盒、電泳試劑盒等

1.2 儀器與設備

單道可變量程移液槍：German eppebdof Co.，Ltd；全溫振蕩培養(yǎng)箱QHZ-98A：太倉市華美生化儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-260：上海市申賢恒溫設備公司；美的電磁爐SN2105T：美的集團（中國）有限公司；漩渦混合儀SI-T256型：美國科學工業(yè)有限公司；離心機Centrifuge 5418R：German eppebdof Co.，Ltd；電泳儀（DYPC-31DN）型：六一生物科技（北京）有限公司；PCR儀Mastercycle：German eppebdof Co.，Ltd；DYY-6C型電泳儀電源：六一生物科技（北京）有限公司；Gel Doc? EZ imager凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad中國公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基配方：牛肉浸出膏1.5 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉2.5 g，蒸餾水500 mL.

固體培養(yǎng)基配方：牛肉浸出膏1.5 g，蛋白胨5.0 g，瓊脂粉10 g，氯化鈉2.5 g，蒸餾水500 mL.

1.3.2 提取細菌DNA

常規(guī)實驗室提取DNA模板有煮沸法、丙酮法、CTAB法、凍融法等，本實驗是一種相對快捷的提取方法，模板也能滿足PCR的要求［5-8］.

從致病鯽魚腸道中用無菌操作取混合物，3次平板劃線分離，將純化的菌種放置EP管中，用移液槍汲取500 μL的無菌雙蒸水，加入到EP管中蓋上蓋子，強力震蕩促使細菌溶解于無菌水中.將混勻后的EP管放置于水浴鍋下95 ℃水浴5 min，然后取出來，置離心機中12 000 r/min轉速離心2 min，以上清液作為模板.

1.3.3 16S rRNA基因序列PCR擴增

按照引物（10 μmol/L）2 μL+2 μL、模板5 μL、dNTP（2.5 μmol/L）4 μL、Taq酶0.25 μL、10×PCR buffer 5 μL、無菌雙蒸水31.75 μL配制50 μL PCR體系.設置預變性溫度為95 ℃，變性時間為5 min，變性溫度時間95 ℃、30 s，退火溫度時間55 ℃、30 s，延伸溫度時間72 ℃、2 min，變性退火延伸3個過程循環(huán)30次［9］.

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳

按順序使用移液槍取5 μL的PCR成品和1 μL Loading buffer 混合均勻，加樣于含有1%Andy safe 的瓊脂糖凝膠塊上，設置100 V電壓、30 min，并置于凝膠成像儀上成像.在1 500 bp和750 bp處出現(xiàn)單一條帶即為有效擴增.

2 結果與分析

2.1 電泳圖譜結果及分析

17組實驗樣品在提取DNA以后進行了16S rRNA基因的PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、凝膠系統(tǒng)成像后，引物1組在1 500 bp處獲得了單一陽性條帶，引物2組在1 000 bp處也獲得了單一條帶，與預計片段大小吻合（見圖1）.前1～12為引物1擴增的1 500 bp的DNA條帶，而后12個則是在引物2下擴增的DNA條帶.從圖1可以看出這次的條帶都存在上翹的現(xiàn)象.由于本次試驗所用電壓為100 V（正常），點樣與載體也都混合均勻，推測可能是上樣量偏多的緣故.

圖1 1～12號電泳情況

圖2和圖1大致相同，實驗使用的PCR退火溫度為55 ℃，而適當提高退火溫度可增強擴增條帶特異性，從而使條帶更加單一.

圖2 13～17號電泳情況

2.2 序列圖譜處理及分析

使用chromas軟件打開測序結果，先打開上游引物PCR擴增的結果，并對測序結果兩端不穩(wěn)定的峰進行裁剪（見圖3和圖4）.再打開相應下游引物的測序結果，同樣對兩端不穩(wěn)定的峰進行去除，可得到一段完整的反向序列.上網(wǎng)進行在線的堿基反向序列互補，從而獲得一條正向序列，并與前面的正向序列進行拼接，即可得到一段相對完整的DNA片段.

2.3 序列比對結果及分析

表1 16SrRNA基因序列鑒定結果

本次16個菌種被鑒定分別屬于4個菌屬：芽孢桿菌、希瓦氏菌、短波單胞菌、氣單胞菌.其中分離鑒定得到的芽孢桿菌是一類對水產(chǎn)養(yǎng)殖有益的細菌群.芽孢桿菌進入水體養(yǎng)殖環(huán)境后，可以附著于魚群表面，也可以生存于魚類的消化道，成為對魚類機體有利的群落.芽孢桿菌的增殖會對其他有害細菌形成競爭性的抑制，因此提高了水產(chǎn)動物的抵抗力，相關實驗研究發(fā)現(xiàn)Bacillus還能夠增強動物體的特異性免疫及非特異性免疫能力.

圖3 基因測序峰圖前端

圖4 基因測序峰圖后端

2.4 幾類鑒定的病原細菌

Shewanella xiamenensis：和希瓦氏菌屬的其他種一樣同屬革蘭氏陰性細菌，兼性厭氧，極性單鞭毛運動，不能形成芽孢.Shewanella xiamenensis首次被分離出來是在我國福建省廈門沿海海洋沉積物中.近些年陸續(xù)從淡水魚體內分離得到這一細菌，結果卻發(fā)現(xiàn)不僅是淡水魚，甚至是海水魚中分離得到的菌株也能夠在無鹽的條件下生長，說明希瓦氏菌可以通過調節(jié)嗜鹽的能力來適應外界環(huán)境的需要.然而希瓦氏菌的入侵感染對水產(chǎn)養(yǎng)殖的威脅日益嚴重，有些菌株甚至會引起水產(chǎn)魚類的急性敗血癥，導致魚類大量死亡.然而當前關于希瓦氏菌在魚類病理學的研究卻很少［10］.

Aeromonas veronii：氣單胞菌是一類在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面被學者作為重點研究對象的致病細菌，它能造成大面積水產(chǎn)動物爆發(fā)疾病，其中危害最大的就是細菌性出血病，該病往往會對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成不可預計的經(jīng)濟損失.維氏氣單胞菌廣泛存在于河流、池塘及湖泊等大多數(shù)淡水水域以及土壤和水生動物體內，可引起鯽魚發(fā)病，大多數(shù)表現(xiàn)為腹水以及出血.此外它也可引發(fā)人的腹瀉、腦膜炎和敗血癥等，情況嚴重時甚至可能導致免疫力低下者死亡.維氏氣單胞菌被發(fā)現(xiàn)是一種新的人魚共患致病細菌，它不僅對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，甚至對人類的健康也具有一定的危害性［11-12］.最近幾年，越來越多有關于維氏氣單胞菌毒力因子的報告，顯示其菌株的毒性慢慢增強，值得水質監(jiān)管部門重視.

Brevundimonas：短波單胞菌常常生存于河流、湖泊、土壤等環(huán)境中，但它卻是比較罕見的病原細菌，也是一種目前人類罕見的條件致病微生物，可以引發(fā)人體肺炎、敗血癥、皮膚炎癥等.但目前尚未發(fā)現(xiàn)它對水產(chǎn)鯽魚養(yǎng)殖的危害.

3 結論

目前，隨著水產(chǎn)鯽魚高密度養(yǎng)殖和集約化程度的提升，鯽魚在養(yǎng)殖過程中的發(fā)病率和死亡率均有大幅度的上升趨勢，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害也越來越大.而傳統(tǒng)的鑒定技術因診斷落后及結果不準確而存在很大的局限性，導致細菌性魚病得不到及時準確的診斷與控制.隨著分子技術的日益成熟，核酸序列分析技術已經(jīng)廣泛應用于細菌的鑒定［13］.因此，核酸分子鑒定技術也將成為水產(chǎn)致病菌鑒定的一項重要技術.

本實驗通過從鯽魚的病變部位挑取細菌來分離獲得單菌，使用便捷的方法提取細菌DNA作為PCR模板進行16S片段的擴增，并通過比對16S rRNA基因片段來分析鑒定確認分離的細菌種類，證實了將16S rRNA基因序列分析技術應用于水產(chǎn)鯽魚病原細菌鑒定的可行性，同時也成功鑒定了一類較其他病原菌而言對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害較大的細菌——維氏氣單胞菌.它是目前魚類致病菌研究的一個熱點.對其快速、準確的鑒定對于及時采取措施、控制病情以及科學防控，實現(xiàn)水生動物的健康養(yǎng)殖具有重要意義.