戴鳴凱，張志忠，劉 爽，樊佳茹，王革伏,3

（1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州350002；2福建農(nóng)林大學(xué)-戴爾豪西大學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，福州350002；3戴爾豪西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，植物食品和環(huán)境科學(xué)系，加拿大新斯科舍B2N5E3）

0 引言

高溫是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的重要問題，隨著全球氣候變暖，溫度逆境對農(nóng)作物生產(chǎn)影響越來越大。馬鈴薯屬茄科多年生草本植物，為糧菜兼用型作物，目前已成為繼小麥、水稻和玉米之后的第四大作物，中國是馬鈴薯第一生產(chǎn)大國，在糧食安全方面馬鈴薯扮演著重要角色。高溫會嚴(yán)重抑制馬鈴薯生長發(fā)育、產(chǎn)量形成和品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致大幅減產(chǎn)，造成經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。進(jìn)行高溫脅迫對馬鈴薯的影響研究具有較為重要價(jià)值。高溫脅迫可對植物多方面產(chǎn)生不良影響，模擬大氣增溫田間試驗(yàn)表明高溫脅迫可使馬鈴薯生理生態(tài)和產(chǎn)量形成過程發(fā)生了顯著變化[4]，高溫會減少馬鈴薯塊莖數(shù)目及大小[5]，塊莖形成過程受到高溫抑制可能是影響其生物量及產(chǎn)量的原因[6-7]。采用數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)建模分析表明隨著氣候變暖，氣溫升高，2080—2100年期間南亞區(qū)域印度的馬鈴薯產(chǎn)量將降低10%～40%[8]。研究表明，高溫脅迫會打亂植物生理代謝，損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然而面對脅迫植物會啟動(dòng)自身的保護(hù)機(jī)制來減少受到的傷害[9-10]。試驗(yàn)以馬鈴薯品種‘閩薯1號’為材料，研究了持續(xù)高溫脅迫下馬鈴薯幼苗植株生長情況變化，超氧陰離子(O2-)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)和脯氨酸(Pro)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等酶活性的變化，研究結(jié)果將有助于深入理解高溫逆境對馬鈴薯生長發(fā)育和生理生化變化的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘閩薯1號’（費(fèi)烏瑞它×大西洋，高產(chǎn)、抗病、適應(yīng)性強(qiáng)，商品薯率高、食用品質(zhì)好，無裂薯、薯型橢圓），由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種薯處理 置于人工氣候箱避光，氣溫20℃（恒溫），濕度30%，放置2周，促進(jìn)頂芽生長，待頂芽長至豆粒大小，溫度降至12℃（恒溫），并給予光照，光照強(qiáng)度為144μmol/(m2·s)，抑制頂芽生長，促進(jìn)其他芽眼萌芽。

1.2.2 材料處理 馬鈴薯塊莖切塊，每個(gè)薯塊質(zhì)量控制在50 g左右，在花盆中以草炭土、蛭石和珍珠巖按照3:1:l的比例培養(yǎng)，每盆1株，在自然溫光條件下室溫培養(yǎng)至株高15 cm左右，選擇生長相對一致的幼苗移至人工氣候箱，調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度為144μmol/(m2·s)，空氣濕度為75%，光照16 h，暗培養(yǎng)8 h；3個(gè)溫度處理：22/14℃作為對照，35/27℃、39/31℃作為高溫處理，每一個(gè)處理放置15株生長相對一致的幼苗，以0、1、3、5、7天為取樣時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)溫度同一時(shí)間點(diǎn)取3株幼苗，每株取第3～5葉位展開的生長相對一致的功能葉2片，為減小試驗(yàn)誤差葉片去掉葉脈并剪碎混樣，單個(gè)指標(biāo)每個(gè)樣品取0.1 g，使用錫箔紙包裹，立即使用液氮充分冷凍，使用塑封袋放置-80℃低溫保存以測定生理指標(biāo)，取樣前拍攝照片并記錄植株生長狀況。所有試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.3 生理指標(biāo)測定 超氧陰離子(O2-)含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生理指標(biāo)測試試劑盒測定：0.1 g組織樣品添加1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，然后1000 g，4℃，離心20 min，取上清置冰上待測，按測定操作表依次加入指定試劑，混勻，8000 g，25℃，離心5 min，吸取上層水相1 mL，加入1 mL玻璃比色皿，分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，波長調(diào)節(jié)至530 nm，空白調(diào)零，測定A530，按樣本質(zhì)量計(jì)算超氧陰離子含量（umol/g鮮重），如式(1)所示。

丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)和脯氨酸(Pro)的含量以及SOD、POD、CAT的酶活性均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生理指標(biāo)測試試劑盒測定（樣品提取、測定及數(shù)據(jù)計(jì)算）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用WPS Excel和DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行處理，以單因素方差分析(one-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD)分析不同脅迫溫度下生理指標(biāo)的差異。試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)-戴爾豪西大學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，于2017年9月—2018年1月進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株生長表型隨脅迫時(shí)間的變化

高溫脅迫明顯了影響馬鈴薯幼苗生長發(fā)育（圖1），35℃與39℃高溫處理的第0、1天，植株還未表現(xiàn)出生長的異常，從第3天起，2個(gè)高溫處理下的植株生長緩慢，葉片萎焉，22℃常溫處理下的植株生長良好；觀察發(fā)現(xiàn)（見圖2a、b）35℃下第5天的馬鈴薯幼苗葉片不僅短小，且葉片、葉柄（見圖2c）發(fā)生明顯的卷曲，頂葉與側(cè)葉的大小也小于常溫對照，圖3顯示幼苗葉片長度在常溫與高溫下存在顯著性差異，常溫下幼苗葉片生長速度高于高溫處理，35℃與39℃高溫處理下葉片生長緩慢，尤其是39℃高溫，呈現(xiàn)出非常緩慢的生長速率，葉片長度顯著小于35℃。

2.2 保護(hù)酶活性隨脅迫時(shí)間的變化

植物在受到環(huán)境脅迫時(shí)，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性來清除體內(nèi)積累的活性氧，以減輕植物體受到來自活性氧的傷害。高溫脅迫對馬鈴薯幼苗SOD、POD、CAT活性的影響如圖4。

圖1 不同溫度下植株的生長表型記錄

圖2 高溫下植株及葉片生長表型

SOD從第1天開始2組高溫處理下，SOD的活性顯著上升，其中第1天35℃處理下的SOD活性提高了約113%，39℃下提高約107%；但隨著脅迫時(shí)間的延長，第3、5、7天高溫處理下由于脅迫程度的加強(qiáng)，SOD的活性持續(xù)降低，常溫處理一直處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)。如圖4(b)顯示，35℃下POD活性于第1天顯著上升，于第3、5天下降，又于第7天上升，而39℃時(shí)，POD在第1天就出現(xiàn)了降低的趨勢，隨著脅迫的加劇，活性又緩緩升高；與SOD類似，35℃高溫下的活性要高于39℃。如圖4(c)顯示，高溫處理第1天CAT活性顯著降低，35℃CAT活性下降約31.7%，39℃更是下降約55.8%，但隨著脅迫時(shí)間的延長，CAT活性又逐漸升高，與SOD、POD不同的是，39℃下CAT活性的上升更為顯著?？偠灾?，受到高溫脅迫，SOD，POD，CAT活性均有顯著變化，其中SOD活性受到脅迫第一時(shí)間顯著上升，隨著脅迫時(shí)間的延長而緩慢降低，而POD與CAT表現(xiàn)出大致先下降而后升高的趨勢。

2.3 MDA含量隨脅迫時(shí)間的變化

高溫脅迫會加劇植物細(xì)胞膜的膜質(zhì)氧化，而MDA是膜質(zhì)氧化產(chǎn)物之一。如圖5，35℃和39℃高溫處理植株的MDA含量隨著脅迫時(shí)間的延長而逐漸增長，表明植株葉片膜質(zhì)氧化程度正在逐漸增強(qiáng)，常溫處理則無顯著變化；同時(shí)35℃與39℃高溫處理之間也具有顯著性差異，可以發(fā)現(xiàn)39℃下植株的MDA含量要顯著高于35℃。SOD是清除氧自由基緩解植物膜質(zhì)過氧化的主力軍，盡管SOD活性大大提高如圖4(a)，MDA含量依舊在持續(xù)增多，可見隨著脅迫的增強(qiáng)，通過植物體自身來緩解傷害的能力還是很有限的。

2.4 O2-和H2O2含量隨脅迫時(shí)間的變化

O2-是生物體受到脅迫后首先生成的氧自由基，可以經(jīng)過一系列反應(yīng)而生成其他氧自由基，參與啟動(dòng)膜質(zhì)過氧化[11]，如圖6(a)，35℃與39℃高溫下O2-含量相對于常溫的增長并不顯著，其中第5天2個(gè)高溫下的O2-含量顯著高于常溫且39℃顯著高于35℃。SOD在清除超氧陰離子的同時(shí)又會有H2O2生成，如圖6(b)顯示，從第3天開始到第7天，H2O2含量持續(xù)增加，到第7天為止35℃下H2O2含量相比于0天增加了約79.4%之多，39℃增加了約64.6%。CAT是參與清除H2O2的主力軍，雖然CAT的活性隨著脅迫的持續(xù)活性逐漸提高如圖4(c)，但H2O2含量依舊沒有降低，這可能是因?yàn)槊{迫所產(chǎn)生H2O2的速度超出了CAT的清除速度，導(dǎo)致植株來不及清除體內(nèi)不斷產(chǎn)生的H2O2，以至于H2O2不斷積累增多。

圖3 葉片長度隨脅迫時(shí)間的變化

圖4 保護(hù)酶活性隨脅迫時(shí)間的變化

圖5 MDA含量隨脅迫時(shí)間的變化

圖6 O2-和H2O2含量隨脅迫時(shí)間的變化

2.5 葉片Pro含量隨脅迫時(shí)間的變化

脯氨酸是植物的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，一般認(rèn)為高溫脅迫下植物體內(nèi)的Pro含量會顯著增加[12]，如圖7，Pro含量從第1天開始持續(xù)上升，且在39℃高溫下積累的量要高于35℃；35℃與39℃處理下在第1、3天出現(xiàn)了相似的升高幅度與趨勢，但從第5天開始，39℃下植株的Pro含量增幅要顯著高于35℃，第5天39℃下Pro含量相對于常溫增長了約44.4%，35℃下僅增加了約18.3%，第7天39℃下Pro含量相對于常溫增長了約49.1%，35℃下僅增長了約18.8%；說明隨著高溫脅迫的持續(xù)和加強(qiáng)，會使馬鈴薯幼苗體內(nèi)產(chǎn)生并積累更多的脯氨酸；常溫對照組脯氨酸含量則無顯著變化。

3 討論

植物受在高溫脅迫下，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化均會受到一定程度的影響。尤超等[13]以油桃為材料，發(fā)現(xiàn)在33℃高溫下嫁接苗初期幾乎不受影響，僅在第三天出現(xiàn)少部分葉片卷曲，但在39℃和45℃下，隨著受害指數(shù)的增加，葉片出現(xiàn)卷曲、皺縮、變軟的概率大大上升，成正相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果十分相似。研究表明高溫會使植物體內(nèi)累積更多活性氧，而植物體內(nèi)清除活性氧的酶類主要有SOD、POD、CAT等，SOD可以催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)而產(chǎn)生氧氣和過氧化氫，大大減少超氧陰離子的含量從而減輕其對植物的傷害；與此同時(shí)產(chǎn)生的H2O2可產(chǎn)生氧化能力極強(qiáng)的羥基自由基和單線態(tài)分子氧，這將對植物細(xì)胞造成很大的傷害，因此POD和CAT將會進(jìn)一步清除產(chǎn)生的H2O2從而保護(hù)植物體[14-15]。本試驗(yàn)中，馬鈴幼苗受到高溫處理時(shí)，SOD在高溫初期活性大幅提升，而隨著高溫的持續(xù)，活性持續(xù)降低，這可能與高溫的持續(xù)在一定程度上破壞了酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)，也有相關(guān)研究在烏菜幼苗和大白菜上發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律[16-17]；本試驗(yàn)中POD、CAT活性與SOD活性不同，出現(xiàn)了先降低后升高的趨勢，這可能與初期高溫脅迫了植物體抑制了酶的活性有關(guān)，同時(shí)SOD清除超氧陰離子時(shí)產(chǎn)生了H2O2，H2O2積累再一次脅迫植物體，植物體便逐漸提高了POD與CAT活性以保護(hù)自身。其中35℃時(shí)，POD活性在第1天有顯著提高，可能是由于35℃對植株未構(gòu)成足夠強(qiáng)脅迫，同時(shí)在初期伴隨著一定量H2O2的產(chǎn)生，植株本能的提高了其活性，而隨著高溫的持續(xù)，脅迫加重，POD活性又在第3天降低，到后期H2O2大量積累，植株通過提高POD活性來應(yīng)對脅迫，葉凡等[17]也在不結(jié)球白菜上發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。這幾種重要的抗氧化酶適應(yīng)高溫脅迫的特點(diǎn)不同，對高溫脅迫的反應(yīng)也有一定的差異。

膜質(zhì)過氧化是高溫對細(xì)胞膜傷害的一種表現(xiàn)，MDA是膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，也是細(xì)胞膜被破壞的標(biāo)志物質(zhì)。研究表明，高溫處理下，大多數(shù)植物的MDA含量都表現(xiàn)為增加的趨勢[19]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。馬德華利用黃瓜幼苗獲得了MDA含量與高溫脅迫的正相關(guān)[20]；孫保娟等人研究了番茄在持續(xù)高溫下MDA含量的變化，也得到了一樣的結(jié)果。超氧陰離子和H2O2是引發(fā)膜質(zhì)過氧化的主要物質(zhì)，隨著高溫脅迫的延長，其含量都會逐漸積累，對植物體造成進(jìn)一步的傷害。脯氨酸(Pro)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其調(diào)節(jié)作用被廣泛研究，研究表明，高溫脅迫下植物體內(nèi)Pro含量會明顯增加[12]。李威等[21]在茄子耐熱性研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)耐熱性與脯氨酸含量的關(guān)聯(lián)達(dá)到顯著水平；另外耐熱性強(qiáng)的水稻品種在高溫脅迫下游離脯氨酸的增加幅度更大[22]。

綜上所述，高溫脅迫對馬鈴薯幼苗生長與生理生化代謝都造成一定程度的影響，植株生長萎焉、葉片生長緩慢，同時(shí)加劇植株水分喪失，膜質(zhì)過氧化加劇，活性氧含量增加，導(dǎo)致葉片卷縮，甚至出現(xiàn)了損傷。馬鈴薯植株通過調(diào)節(jié)體內(nèi)保護(hù)酶活性、提高脯氨酸含量等手段來緩解持續(xù)的高溫脅迫。

圖7 Pro含量隨脅迫時(shí)間的變化