王勇，湯育新，陽(yáng)建福，段燚星

（1.湖南省人民醫(yī)院 泌尿外科，湖南 長(zhǎng)沙 410005；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 泌尿外科，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

精原細(xì)胞瘤是睪丸生殖細(xì)胞腫瘤最常見的類型，約占總數(shù)的55%，其發(fā)病機(jī)制仍未闡明，對(duì)相關(guān)發(fā)病基因進(jìn)行篩選及功能研究是目前的熱點(diǎn)。TDRG1（testis development related gene 1）是筆者通過(guò)“數(shù)據(jù)庫(kù)削減雜交技術(shù)”克隆并證實(shí)的睪丸特異性基因，其表達(dá)的組織特異性及時(shí)間特異性與精原細(xì)胞瘤的發(fā)病特征相吻合，提示TDRG1可能是精原細(xì)胞瘤的發(fā)病相關(guān)基因。因此，本研究應(yīng)用大樣本的精原細(xì)胞瘤組織芯片，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)TDRG1的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，并首次對(duì)TDRG1與精原細(xì)胞瘤患者年齡及腫瘤TNM分期等病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，希望能夠?yàn)榫?xì)胞瘤提供新的研究思路及可能的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用組織芯片購(gòu)于西安艾麗娜生物科技公司，共包含106例精原細(xì)胞瘤組織及35例正常睪丸組織，相關(guān)臨床病理資料由西安艾麗娜生物科技公司提供，其中正常睪丸組織主要為嚴(yán)重睪丸外傷患者行睪丸切除術(shù)及前列腺腫瘤患者行手術(shù)去勢(shì)治療所切除的睪丸組織，相關(guān)實(shí)驗(yàn)已獲得湖南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入研究的106例精原細(xì)胞瘤患者，年齡15～80歲，平均年齡41.5歲，根據(jù)睪丸生殖細(xì)胞腫瘤TNM分期進(jìn)行分類，T1期62例，T2期32例，T3期2例，T4期10例。

1.2 試劑與方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)組織芯片進(jìn)行染色，經(jīng)過(guò)脫蠟、浸水和水化后，將芯片置于95℃檸檬酸鈉溶液中抗原修復(fù)20 min，冷卻至室溫。用山羊血清室溫下封閉25 min，滴加一抗即TDRG1單克隆抗體（湖南遠(yuǎn)泰生物技術(shù)公司，1︰5 000稀釋），放入濕盒中4℃過(guò)夜，然后以pH7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗3次，按照免疫組化試劑盒KIT-5020（福州邁新生物公司）說(shuō)明書進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色。

1.3 結(jié)果判定

在每個(gè)標(biāo)本病變典型處隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍視野（HPF×400），將胞漿內(nèi)出現(xiàn)的棕黃色染色標(biāo)記為TDRG1陽(yáng)性表達(dá)，通過(guò)圖像分析軟件Motic Fluo 1.0測(cè)量棕黃色染色面積的光密度值，取平均值代表該樣本 TDRG1的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用樣本均數(shù)間t檢驗(yàn)進(jìn)行分析；計(jì)量資料與等級(jí)資料間相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)，計(jì)量資料間相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TDRG1在精原細(xì)胞瘤和正常睪丸組織中的表達(dá)

研究結(jié)果顯示，TDRG1在正常睪丸和精原細(xì)胞瘤組織中均有表達(dá)，見圖1。在正常睪丸組織中，TDRG1主要表達(dá)在生精細(xì)胞內(nèi)；在精原細(xì)胞瘤組織中，TDRG1主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞漿中，在腫瘤間質(zhì)中未見明顯表達(dá)。TDRG1在精原細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯高于正常睪丸組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖1 正常睪丸組織及精原細(xì)胞瘤組織TDRG1免疫組織化學(xué)染色（×400）

圖2 TDRG1在正常睪丸及精原細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)

2.2 TDRG1的表達(dá)與精原細(xì)胞瘤TNM分期等參數(shù)的關(guān)系

研究結(jié)果顯示，TDRG1在精原細(xì)胞瘤不同TNM分期中的表達(dá)具有明顯差異，見圖3。TDRG1表達(dá)水平與精原細(xì)胞瘤TNM分期存在正相關(guān)性（r =0.877，P＜0.001），見圖4。TNM分期越高，TDRG1表達(dá)水平越高。TDRG1的表達(dá)水平與精原細(xì)胞瘤患者的年齡無(wú)明顯相關(guān)性（r =0.101，P =0.301＞0.05），見圖 5。

圖3 TDRG1在精原細(xì)胞瘤不同TNM分期中的表達(dá)分析

圖4 TDRG1表達(dá)與精原細(xì)胞瘤TNM分期的相關(guān)性分析

圖5 TDRG1表達(dá)與精原細(xì)胞瘤患者年齡的相關(guān)性分析

3 討論

近年來(lái)，睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，其發(fā)病隱匿，多見于青壯年，若不能及時(shí)診斷和治療，會(huì)很快發(fā)生擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生殖健康甚至生命[1]。睪丸生殖細(xì)胞腫瘤可分為精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、畸胎癌以及卵黃囊瘤等，其中精原細(xì)胞瘤是最為常見的類型[2]。形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遺傳學(xué)分析表明精原細(xì)胞瘤可能是睪丸生殖細(xì)胞腫瘤共同的前身病變[3-5]，因此對(duì)精原細(xì)胞瘤進(jìn)行研究有助于闡明睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的發(fā)病機(jī)制。眾所周知，腫瘤的發(fā)病是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，雖然目前推測(cè)P53、Bcl-2等基因可能與精原細(xì)胞瘤的發(fā)病相關(guān)[6]，但精原細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，說(shuō)明可能有未知基因參與其發(fā)病過(guò)程，因此對(duì)新的發(fā)病相關(guān)基因進(jìn)行篩選和功能研究具有重要的臨床意 義。

TDRG1是筆者運(yùn)用“數(shù)據(jù)庫(kù)消減雜交”方法克隆的新基因，GenBank登錄號(hào)為DQ168992，定位于6p21.2-p21.2，全長(zhǎng)1197 bp，開放閱讀框?yàn)?04～806 bp，其編碼的蛋白由100個(gè)氨基酸組成，分子量為10 KD，等電點(diǎn)為6.81，通過(guò)Blast檢索nr數(shù)據(jù)庫(kù)以及氨基酸序列同源比較分析顯示TDRG1基因及蛋白與其他已知蛋白質(zhì)無(wú)同源性，表明該基因及其產(chǎn)物均是全新的[7]。本研究前期試驗(yàn)中，首先制備了高效價(jià)的小鼠抗人TDRG1單克隆抗體[8]，進(jìn)而通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）的方法證實(shí)TDRG1僅表達(dá)于人睪丸組織，在人心臟、肝、腦、肺、腎、脾、附睪等組織中無(wú)表達(dá)，表明TDRG1的表達(dá)具有明顯的組織特異性。與此同時(shí)，發(fā)現(xiàn)TDRG1的表達(dá)還具有年齡特異性，即在青壯年男性的睪丸組織中高表達(dá)[9]，TDRG1的這些表達(dá)特點(diǎn)與精原細(xì)胞瘤的發(fā)病特征相吻合，提示TDRG1可能是精原細(xì)胞瘤的發(fā)病相關(guān)基因。在腫瘤的發(fā)病中，分子信號(hào)通路發(fā)揮著重要作用，Kemmer等[10]研究認(rèn)為KIT/PI3K/AKT通路的異常激活存在于大多數(shù)精原細(xì)胞瘤中，說(shuō)明KIT/PI3K/AKT通路是精原細(xì)胞瘤發(fā)病過(guò)程中主要的信號(hào)通路，并且有獨(dú)特的意義。前期的試驗(yàn)中，筆者在2010年曾經(jīng)應(yīng)用組織芯片對(duì)TDRG1的表達(dá)進(jìn)行過(guò)初步檢測(cè)[11]，但樣本量較?。╪ =26），結(jié)果顯示TDRG1在精原細(xì)胞瘤中表達(dá)低于正常睪丸組織，可能為抑癌基因。隨著后續(xù)研究的深入，Western Blot、PCR以及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TDRG1可以通過(guò)PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)精原細(xì)胞瘤TCam-2細(xì)胞增殖，具有癌基因的潛能[12]，這與筆者前期小樣本精原細(xì)胞瘤組織芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是矛盾的。因此為了進(jìn)一步研究TDRG1與精原細(xì)胞瘤的關(guān)系，在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用大樣本的精原細(xì)胞瘤組織芯片（n =106例）對(duì)TDRG1的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TDRG1在精原細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常睪丸組織（P＜0.001），與精原細(xì)胞瘤TCam-2細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的，兩者相互佐證，證實(shí)TDRG1可能是精原細(xì)胞瘤發(fā)病相關(guān)基因，具有癌基因潛能。目前為止尚無(wú)研究對(duì)TDRG1與精原細(xì)胞瘤患者腫瘤分期等臨床參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，為了進(jìn)一步探討TDRG1在精原細(xì)胞瘤中的臨床意義，在本實(shí)驗(yàn)中還首次對(duì)TDRG1與精原細(xì)胞瘤患者年齡及TNM分期的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示TDRG1的表達(dá)與患者的年齡無(wú)明顯相關(guān)性，但TDRG1的表達(dá)水平與精原細(xì)胞瘤的TNM分期存在強(qiáng)正相關(guān)性，TNM分期越高，TDRG1的表達(dá)水平越高，表明TDRG1可能參與了精原細(xì)胞瘤的發(fā)展過(guò)程。由于該組織芯片缺少患者生存期等臨床資料，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者數(shù)目較少，因此TDRG1與精原細(xì)胞瘤患者生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的相關(guān)性以及TDRG1是否能夠作為精原細(xì)胞瘤的預(yù)后判斷指標(biāo)還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究主要是應(yīng)用組織學(xué)的方法對(duì)TDRG1與精原細(xì)胞瘤的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，筆者認(rèn)為TDRG1可能作為癌基因通過(guò)參與精原細(xì)胞瘤的發(fā)病過(guò)程，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。此外，蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位與其功能是密切相關(guān)的，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TDRG1主要表達(dá)在正常睪丸組織的生精細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的胞漿中，但TDRG1的亞細(xì)胞定位仍不清楚，因此在后續(xù)的研究中，將應(yīng)用免疫電鏡等方法對(duì)TDRG1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，以更加全面深入地闡述TDRG1的作用機(jī)制和生物學(xué)功能。