馬麗，劉正君，姚東風(fēng)，胡宗苗，鄧穎穎，張恩戶

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥理教研室，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.西安市閻良區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科，陜西 西安 710089；3.陜西省旬陽(yáng)縣中醫(yī)院 藥劑科，陜西 安康 725700）

宮頸疾病嚴(yán)重影響著現(xiàn)代女性的身心健康，宮頸上皮細(xì)胞的分化階段與宮頸糜爛、人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus, HPV）感染和癌變密切相關(guān)[1]。形態(tài)學(xué)研究表明宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)是宮頸疾病的好發(fā)部位[2]。轉(zhuǎn)化區(qū)位于宮頸管柱狀上皮和復(fù)層鱗狀上皮之間。該區(qū)域的特征是鱗狀上皮化生，而生長(zhǎng)旺盛的鱗狀上皮層最易受外界因素影響[3]。研究宮頸上皮的分裂分化對(duì)于研究宮頸疾病的發(fā)病機(jī)制非常重要。這就需要對(duì)宮頸上皮細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),由于人的宮頸上皮不易取得，手術(shù)過(guò)程中分離得到的宮頸上皮一般分化程度較高，本文選擇從大鼠身上取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器

上皮細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基（Gibco 1517550），牛腦提取物（Bovine Pituitary Extract,gibco 13028-014），表皮生長(zhǎng)因子（EGF Human Recombinant, Gibco 13028-014），D-PBS（Gibco,1607816），胰蛋白酶（0.25%, Amresco），雙抗（BioTop）；100級(jí)超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（Binder公司），XDS-1倒置生物顯微鏡（重慶光電儀器有限公司），低速離心機(jī)（江蘇省金壇市正基儀器有限公司），全自動(dòng)高壓滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠），SG超純水儀，HH-1電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司），分析電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），101電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雌性，體重（45±5）g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：陜動(dòng)字10- 13。

1.3 方法

大鼠宮頸上皮細(xì)胞（RCEC）的分離參照文獻(xiàn)[4]，略微改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行的，40～50 g的雌性大鼠脫臼處死，75%的乙醇溶液浸泡15 min，縱向剖開，剪取宮頸至子宮角處組織，D-PBS（含鏈霉素 100 μg/ ml，青霉素 100 u/ml）沖洗 5 次，剪碎組織，0.2%膠原酶溶液37℃消化（3次，每次5 min），細(xì)胞篩過(guò)濾，3 000 rpm離心5 min，37℃培養(yǎng)。大鼠宮頸鱗狀上皮培養(yǎng)使用上皮細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)血清培養(yǎng)基，添加牛腦提取物250 mg/L，表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor, EGF）20 ng/ml，7.5%無(wú)菌NaHCO3溶液調(diào)pH至7.4。細(xì)胞接種第3天換液，之后隔一天換一次液。

2 結(jié)果

上述方法分離的大鼠宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)8 d后，可以在顯微鏡下觀察到宮頸上皮細(xì)胞從組織碎片中移出，大片貼在培養(yǎng)瓶壁上，成集落狀生長(zhǎng)，扎堆現(xiàn)象嚴(yán)重。宮頸上皮細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核位于中央，有的細(xì)胞正在分裂，可以看到兩個(gè)甚至多個(gè)核，見圖1。由于上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基不添加血清，因此細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢。使用上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基添加EGF、牛腦提取物可以實(shí)現(xiàn)大鼠宮頸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基添加牛腦提取物和EGF可以實(shí)現(xiàn)大鼠宮頸上皮細(xì)胞的初步培養(yǎng)。最佳條件為：40～50 g大鼠，分離宮頸上皮細(xì)胞，膠原酶消化5 min，細(xì)胞篩過(guò)濾，離心，添加牛腦提取物250 mg/L，EGF 20 ng/ml，7.5%無(wú)菌碳酸氫鈉溶液調(diào)整培養(yǎng)基pH為7.4，37℃培養(yǎng)，二氧化碳（CO2）濃度為5%。

圖1 大鼠宮頸上皮細(xì)胞（10×40）

3 討論

大鼠宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)一般需要借助成纖維細(xì)胞層的滋養(yǎng)，本課題首次選擇上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠宮頸上皮細(xì)胞，排除了成纖維細(xì)胞的干擾；相比人宮頸上皮的培養(yǎng)，克服了取材不易的弱點(diǎn)。

生長(zhǎng)因子是一類具有刺激細(xì)胞生長(zhǎng)活性的多肽類細(xì)胞因子；生長(zhǎng)因子與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）是一種由53個(gè)氨基酸組成的對(duì)熱穩(wěn)定的多肽，廣泛存在于人體多種組織及體液中，與其受體結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化[5]。EGF與上皮組織的發(fā)生、發(fā)展、黏膜保護(hù)、潰瘍愈合及潰瘍的愈合質(zhì)量密切相關(guān)，在上皮組織的修復(fù)中起著重要作用[6]。EGF與表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）結(jié)合，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)細(xì)胞分裂。EGF作用的發(fā)揮主要依賴于細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases, ERK 1/2）通路的激活[7]，此通路激活后，絲裂原活化蛋白激酶便從胞液進(jìn)入胞核并誘導(dǎo)c-fos，cmyc和Cyclin D1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[8]。EGF/EGFR在特定細(xì)胞中通過(guò)特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)糖酵解及蛋白質(zhì)、RNA和DNA的合成，從而促使細(xì)胞分裂和增生[9-10]。

THOMAS在對(duì)大鼠宮頸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，證實(shí)了EGF對(duì)大鼠宮頸上皮細(xì)胞促生長(zhǎng)作用，并且分離宮頸上皮細(xì)胞的大鼠體重在40～50 g[11]。有研究表明生長(zhǎng)因子在上皮細(xì)胞培養(yǎng)中可以代替培養(yǎng)基中的血清高分子物質(zhì)起到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作 用[12]。

利用上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠宮頸上皮細(xì)胞是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)創(chuàng)新。后續(xù)應(yīng)該對(duì)大鼠宮頸上皮細(xì)胞的傳代方法進(jìn)行研究，并對(duì)大鼠宮頸上皮細(xì)胞進(jìn)行純化、鑒定。成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的存在限制了宮頸上皮的體外研究，上皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)大鼠宮頸上皮的成功培養(yǎng)可以為體外研究影響宮頸上皮生長(zhǎng)和分化的因素提供一個(gè)細(xì)胞模型。該模型可用于研究激素、致癌物質(zhì)和病毒等干擾因素對(duì)宮頸上皮的影響。這將為宮頸疾病的研究帶來(lái)轉(zhuǎn)機(jī)。