陳莎莎，孫 敏，王文超，李 真，王世梅，戴樂天，徐陽春

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

磷素是植物生長所必需的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，土壤磷素供給不足是制約植物生長發(fā)育的重要因素之一[1]。通常土壤中95%以上磷為無效磷，主要是礦物磷酸鹽類，植物很難直接吸收利用。為了保證產(chǎn)量，每年施入大量磷肥，但施入的磷肥當(dāng)季作物利用率僅為5%～25%[2]，其余依然形成難溶磷，所以提高土壤磷素利用效率一直是科研工作者關(guān)注的課題。前人研究發(fā)現(xiàn)土壤中存在大量的溶磷微生物，能將難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷。溶磷微生物可分為3大類群：溶磷細(xì)菌、溶磷放線菌和溶磷真菌。溶磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌類群有：芽孢桿菌屬（Bɑcillus）、假單胞菌屬（Pseudomonɑs），放線菌中鏈霉菌屬（Streptomyces）溶磷能力較強(qiáng)，溶磷能力較強(qiáng)的真菌為青霉菌屬（Penicillium）、曲霉菌屬（Aspergillus）及AM菌根真菌等[3-7]。

應(yīng)用溶磷微生物活化土壤磷素是一種安全、經(jīng)濟(jì)、有效的農(nóng)業(yè)措施[8]。溶磷微生物通過酸化、螯合和交換反應(yīng)等方式將土壤磷庫中的磷由礦物態(tài)轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)[9]，從而顯著提高土壤中有效磷的含量，促進(jìn)作物生長。Gulden等[10]報(bào)道施用拜萊青霉（Penicillium bilɑii）使豌豆植株根毛量增長了22%并對(duì)豌豆生長有明顯的促進(jìn)作用。Vessey等[1]也發(fā)現(xiàn)在加拿大的兩個(gè)地區(qū)用P.bilɑii接種后，豌豆的根長增加40%，根重提高13%。用該菌株制成的解磷菌劑已在加拿大商品化生產(chǎn)[11]。菌肥不僅促進(jìn)了作物生長，也對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生一定影響。有研究表明菌肥雖然未從本質(zhì)上改變土壤細(xì)菌的種類和分布，但可對(duì)土壤細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生影響[12]。李朔[13]利用DEEG技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，施用細(xì)菌復(fù)合微生物肥料后增加了白菜田土壤中微生物的多樣性。但目前，真菌生物菌肥的研究主要集中于其對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響、作物增產(chǎn)和品質(zhì)改善方面，而對(duì)根際土壤細(xì)菌群落影響的研究報(bào)道較少。

本文以實(shí)驗(yàn)室前期從植物根際土壤中篩選出的2株溶磷真菌菌株為材料[14]，研究其在土壤中的溶磷效果，然后經(jīng)固體發(fā)酵后制成生物菌肥，研究其對(duì)玉米的促生作用，并測(cè)定其對(duì)玉米根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為高效溶磷菌肥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

草酸青霉（Penicillium oxɑlicum）NJDL-03和黑曲霉（Aspergillus niger）NJDL-12，溶磷細(xì)菌腸桿菌（Enterobɑcter sp.）San8[15]，實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

（1）PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1000 mL，瓊脂20 g，pH值保持自然。

（2）NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，H2O 1000 mL，pH值7.0。

1.3 溶磷真菌土培實(shí)驗(yàn)

供試土壤采自安徽省滁州市鳳陽縣安徽科技學(xué)院后山（石灰性土壤），其理化性質(zhì)見表1。

菌株NJDL-03和NJDL-12于PDA平板上涂布培養(yǎng)，于28℃培養(yǎng)4 d后，用無菌生理鹽水洗滌制成孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子數(shù)量，使孢子懸液濃度達(dá)到106個(gè)·mL-1；菌株 Enterobɑcter sp.San8于NA培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d，離心，去除上清液，加入無菌生理鹽水，制成San8菌懸液，涂布計(jì)數(shù)，San8數(shù)量達(dá)到108CFU·mL-1。分別取NJDL-03、NJDL-12孢子懸液及San8菌懸液50 mL接種到裝有250 g過20目篩的土壤中。菌株NJDL-03、NJDL-12及San8每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，并設(shè)置不接菌對(duì)照（CK），各處理置于28℃培養(yǎng)。分別采用鉬銻抗比色法[16]和雷茲pHS-3C pH計(jì)每周測(cè)定土壤速效磷含量和pH值。

1.4 溶磷真菌固體發(fā)酵

設(shè)計(jì)兩種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基1配方為：玉米芯∶麥麩粉∶蚯蚓糞∶稻殼∶黃豆粉=8∶2∶8∶1∶1，發(fā)酵培養(yǎng)基2配方為：玉米芯∶麥麩粉∶稻殼∶菜粕∶黃豆粉=10∶2∶2∶4∶2，料水比均為1∶1。取于28 ℃培養(yǎng)4 d后的NJDL-03和NJDL-12種子液以15%接種量分別接種到裝有250 g的2種已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，每處理5個(gè)重復(fù)，用玻璃棒攪拌均勻并于28℃培養(yǎng)6 d，隨后得到NJDL-03和NJDL-12生物菌肥。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 The soil basic physical and chemical properties

1.5 溶磷真菌對(duì)玉米的促生效果盆栽實(shí)驗(yàn)

供試玉米種子品種為京城12，設(shè)置CK、Substrate（成分是發(fā)酵菌肥的基質(zhì)）、San8、NJDL-03、NJDL-12 5個(gè)處理，每盆裝石灰性土壤5.0 kg，每個(gè)處理重復(fù)5盆。Substrate處理每盆加基質(zhì)50 g，而San8處理每盆加入含50 mL San8菌懸液（菌數(shù)達(dá)到108CFU·mL-1）的基質(zhì)50 g，NJDL-03和NJDL-12處理每盆分別加入相應(yīng)菌肥50 g。盆栽實(shí)驗(yàn)于2015年9月26日至11月19日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)院溫室二樓內(nèi)進(jìn)行，測(cè)定玉米植株生長狀況、用SPAD502葉綠素儀測(cè)定玉米葉片葉綠素含量，每個(gè)處理隨機(jī)挑取3盆，每盆6次，取其平均值。土壤蔗糖酶活性測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法比色法；土壤脲酶活性測(cè)定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；土壤中性磷酸酶活性按S-NP活性測(cè)定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）說明書步驟測(cè)定。

1.6 玉米根際土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)序

在玉米盆栽實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到45 d時(shí)，取玉米根際土壤0.5 g，使用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（MoBio，Power-Soil DNA Isolation Kit）提取土壤DNA，提取操作參照其說明書。將提取后的DNA送至北京諾禾致源生物信息有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。土壤細(xì)菌MiSeq高通量測(cè)序參照Caporaso等[17]的方法，引物為563F（5′-AYT GGG YDT AAA GVG-3′）和802R（5′-TAC NVG GGT ATC TAA TCC-3′）。PCR擴(kuò)增體系為30 μL（2×Master Mix 15 μL；Forward Primer 1 μL；Reverse Primer 1 μL；Template DNA 0.5 μL；ddH2O 12.5 μL），PCR反應(yīng)條件均為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行27個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)整理與計(jì)算用Microsoft Excel 2007軟件，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析與差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 溶磷菌對(duì)土壤pH和速效磷含量變化的影響

土培實(shí)驗(yàn)，不同處理土壤pH、速效磷隨時(shí)間的變化結(jié)果見圖1。石灰性土壤的起始pH為7.84，CK的pH基本維持在7.80上下，而接種溶磷菌處理的土壤pH均有所下降，溶磷細(xì)菌San8處理的pH在第24 d下降到最低值7.62，之后回升維持在7.7左右，而NJDL-03和NJDL-12處理均在第10 d就下降到最低值，分別為7.58和7.55，隨后保持在7.60左右?？赡苁堑胶笃?，溶磷菌生長達(dá)到穩(wěn)定，產(chǎn)酸能力亦趨于穩(wěn)定，而石灰性土壤的緩沖性能對(duì)土壤pH進(jìn)行了一定的調(diào)節(jié)。CK處理土壤速效磷基本沒有變化，San8處理土壤速效磷達(dá)到最高時(shí)僅比CK增加了65.69%。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，而溶磷真菌處理的土壤速效磷含量變化較大，較CK約提高5倍左右，較San8處理提高3倍左右，且NJDL-03處理土壤速效磷比NJDL-12略高。NJDL-03和NJDL-12處理在第10 d土壤速效磷達(dá)到最大值，分別為15.31、14.95 mg·kg-1，隨后維持在 13.50 mg·kg-1左右。分析原因，可能由于菌劑接入土壤中，溶解了部分難溶性的磷，使土壤中的速效磷含量有所上升，但隨著時(shí)間的延長，土壤對(duì)磷素的吸附固定加強(qiáng)使速效磷含量減少，土壤磷素循環(huán)逐漸達(dá)到平衡，速效磷保持相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 不同處理土壤pH、速效磷隨時(shí)間的變化Figure 1 The changes of pH and available phosphorus in soil with different treatments over time

真菌 NJDL-12（R2=0.97）和 NJDL-03（R2=0.81）處理下土壤速效磷變化規(guī)律與pH負(fù)相關(guān)，而細(xì)菌San8處理下相關(guān)性不大（R2=0.32）。

2.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方比較

NJDL-03和NJDL-12在發(fā)酵配方1中發(fā)酵孢子數(shù)分別達(dá)到了4.33×1010個(gè)·g-1和1.66×1010個(gè)·g-1，而在發(fā)酵配方2中發(fā)酵，孢子數(shù)分別為4.67×109個(gè)·g-1和1.33×108個(gè)·g-1（表2）。可見固體發(fā)酵配方1更適合溶磷真菌的生長，可用作后續(xù)盆栽實(shí)驗(yàn)的真菌生物菌肥發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3 不同溶磷生物菌肥處理對(duì)玉米生長的影響

由表3可見，溶磷細(xì)菌San8與Substrate處理對(duì)玉米生長的影響沒有明顯差異，而溶磷真菌NJDL-03、NJDL-12與Substrate處理相比，其間差異顯著；真菌NJDL-12處理的玉米鮮重高于NJDL-03處理，且差異顯著，而干重差異不顯著，但與San8處理相比差異顯著。NJDL-12、NJDL-03、San8、Substrate處理的玉米植株干重分別較CK增加了67.70%、67.14%、33.96%、24.04%。葉綠素是反映植物生長的重要指標(biāo)，NJDL-03、NJDL-12處理的玉米葉片葉綠素分別是CK的1.37、1.33倍，而San8處理是CK的1.16倍。

各處理葉片及根系全磷含量規(guī)律均為：NJDL-12＞NJDL-03＞San8＞Substrate＞CK。NJDL-12葉片和根系全磷分別為 1.26、1.17 g·kg-1，分別比 CK 增長了132.61%、79.67%，NJDL-03比 CK增長了 80.82%、44.67%，而San8僅增長了59.20%、4.61%，且只有葉片全磷差異顯著。圖2中，除CK外，真菌NJDL-12和NJDL-03等玉米根系與葉片全磷含量相比各處理均低于葉片，說明溶磷菌肥和基質(zhì)均能促進(jìn)玉米生長，且對(duì)地上部的促生效果更顯著。

2.4 不同處理對(duì)土壤速效磷含量的影響

圖3顯示不同處理土壤速效磷高低順序?yàn)椋篘JDL-12＞NJDL-03＞ San8＞Substrate＞CK。NJDL-12和NJDL-03處理的土壤速效磷分別為15.87、14.10 mg·kg-1，是 CK的 5.03、4.36倍，而 San8處理及 Substrate處理的土壤速效磷為 4.51、3.43 mg·kg-1，僅較CK提高了0.71、0.30倍。

2.5 不同處理對(duì)土壤中性磷酸酶活性的影響

圖2 不同處理玉米葉片和根系含磷量比較Figure 2 Comparison of phosphorus content in the leaf and root of maize with different treatments

表2 菌株NJDL-03和NJDL-12在兩種固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的孢子數(shù)量Table 2 The number of spores of NJDL-03 and NJDL-12 in different fermentation media

表3 不同處理對(duì)玉米生長的影響Table 3 The effect of different treatment on growth of maize with different treatments

圖3 不同處理土壤速效磷含量變化Figure 3 Changes of the available phosphorus in soil with different treatments

表4中真菌菌肥處理的土壤蔗糖酶、脲酶及中性磷酸酶活性均高于其他處理，且NJDL-12處理的土壤各酶活性略高于NJDL-03處理，但差異不顯著。在土壤蔗糖酶、脲酶及磷酸酶三種酶活中，NJDL-12、NJDL-03分別比San8提高了46.55%、34.74%、25.96%和40.23%、31.48%、15.02%，San8處理則比CK提高了6.78%、18.91.%、35.29%。

2.6 不同處理對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

原始序列經(jīng)過抽提分配后，在97%相似度水平，16SrRNA基因序列共有7624個(gè)OUT。不同處理中玉米根際土壤細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度變化顯示（圖4），根際主要富集了變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria），此三個(gè)細(xì)菌門的豐度分別達(dá)到了50%、20%和10%左右，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflex）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）及疣微菌門（Verrucomicrobia），約占20%，其中厚壁菌門（Firmicutes）豐度僅占1%～3%，各處理較CK豐度明顯降低，有顯著差異性。

圖4 不同處理中根際土壤細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度Figure 4 Relative abundances of bacterial phyla with different treatments

表5中細(xì)菌屬豐度＞1%的有23個(gè)屬，豐度最高的為Gɑiellɑ屬，其次為康奈斯氏桿菌屬（Conexibɑcter）、Subdivision3_generɑ_incertɑe_sedis 類 群 、Povɑlibɑcter屬，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonɑs）、酸土單胞菌屬（Aciditerrimonɑs）和土壤紅桿菌屬（Solirubrobɑcter）等，而豐度＞1%且存在顯著性差異的細(xì)菌屬只有2個(gè)屬，分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonɑs）和類鏈球菌屬（Ohtɑekwɑngiɑ）。San8 處理的土壤 Sphingomonɑs豐度最高，為CK的1.43倍，NJDL-12菌肥處理為CK的1.11倍，NJDL-03菌肥處理與CK差異不顯著。Ohtɑekwɑngiɑ豐度除了NJDL-03菌肥處理外，其余各處理均較CK增加。豐度＜1%的9個(gè)細(xì)菌屬各處理之間差異顯著，尤其是賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibɑcillus）豐度，各處理均較CK顯著降低；其次是豐祐菌屬（Opitutus），經(jīng)真菌菌肥NJDL-03及NJDL-12處理后豐度顯著增加，而細(xì)菌菌肥San8及Substrate處理后與CK相比差異不顯著；分枝桿菌屬（Mycobɑcterium）、小囊菌屬（Plesiocystis）和嗜鹽桿菌屬（Hɑlotɑleɑ）的豐度，各處理相對(duì)于CK均有明顯的增加，真菌菌肥處理后的溶桿菌屬（Lysobɑcter）相對(duì)于CK有所減少。

3 討論

土壤中存在大量的溶磷菌，對(duì)活化土壤磷素起到重要的作用。溶磷草酸青霉NJDL-03和黑曲霉NJDL-12是實(shí)驗(yàn)室分離保存的溶磷效果較好的微生物。將溶磷生物菌肥接種到石灰性土壤中進(jìn)行土培，降低了土壤pH值，提高了土壤速效磷含量。土培實(shí)驗(yàn)45 d，菌株NJDL-03和NJDL-12處理土壤的速效磷分別是CK的4.0、3.9倍，San8處理則是CK的1.54倍，表明真菌的溶磷效率遠(yuǎn)高于溶磷細(xì)菌。Kucey等[18]研究亦發(fā)現(xiàn)真菌的溶磷能力要強(qiáng)于細(xì)菌。前期搖瓶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株NJDL-03主要產(chǎn)生草酸、甲酸、酒石酸、檸檬酸等，產(chǎn)生有機(jī)酸總量4489 mg·L-1，NJDL-12主要產(chǎn)生草酸、甲酸、蘋果酸等有機(jī)酸，產(chǎn)酸總量為10 331 mg·L-1[15]；而菌株san8主要產(chǎn)生草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸等有機(jī)酸，其產(chǎn)酸總量為4153 mg·L-1[16]?？梢娋戤a(chǎn)生有機(jī)酸的種類及數(shù)量不同，是其溶磷能力不同的主要原因，王岳坤等[19]研究報(bào)道不同的有機(jī)酸對(duì)土壤中難溶性磷的溶解效率不同。

表4 不同處理中土壤酶活性的變化Table 4 The changes of soil enzyme activity with different treatments

表5 不同處理根際土壤主要細(xì)菌類群（屬水平＞0.1%）的豐度變化Table 5 The abundance of main bacterial genera in different treatments

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生物菌肥的應(yīng)用增加了土壤速效磷含量，提高了土壤酶活性，并促進(jìn)了玉米植株的生長。為進(jìn)一步深入探索生物菌肥溶磷促生的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了玉米根際細(xì)菌群落的變化，研究發(fā)現(xiàn)所有處理在門水平均具有相同的三大優(yōu)勢(shì)菌群，分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）。這與韓亞飛等[20]研究的變形菌門、放線菌門和酸桿菌門為不同類型土壤的優(yōu)勢(shì)群落的結(jié)果一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門、酸桿菌門的豐度與土壤速效磷含量及土壤酶活變化有顯著的相關(guān)性。李丹[21]研究發(fā)現(xiàn)在不同土地利用方式下，土壤細(xì)菌群落中擬桿菌門及δ-變形菌門與脲酶呈負(fù)相關(guān)，藍(lán)藻及疣微菌與脲酶和過氧化氫酶呈正相關(guān)。這說明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤理化性質(zhì)緊密相關(guān)。

在細(xì)菌屬水平，雖然有些細(xì)菌屬豐度很低，但其具有一些特殊作用，對(duì)土壤理化性質(zhì)的改變及植株的生長不可忽視。各處理的植株根際賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibɑcillus）豐度相對(duì)于CK均減少，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Lysinibɑcillus具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)碳酸鹽礦物形成能力，并且細(xì)菌死亡后的自溶過程會(huì)使環(huán)境pH值升高[22]。菌肥處理后，根際中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonɑs）、小囊菌屬（Plesiocystis）豐度較對(duì)照有所增加，其中Sphingomonɑs是土壤中一類重要的資源微生物，不僅具有較強(qiáng)的降解多環(huán)芳烴的能力[23]，更具有溶磷作用[24]，Plesiocystis則是生態(tài)環(huán)境中磷酸酯和磷酸酶的分解細(xì)菌[25]。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明經(jīng)過溶磷生物菌肥處理之后，對(duì)根際細(xì)菌群落組成有所改變，增加功能微生物的豐度，有利于土壤磷素的溶解，促進(jìn)植物生長。

目前功能生物肥料的研發(fā)、生產(chǎn)已取得了豐碩成果，但由于不同土壤理化性質(zhì)的差異，其應(yīng)用效果穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步提高，故本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為溶磷生物菌肥在生產(chǎn)上應(yīng)用提供了理論參考。

4 結(jié)論

（1）溶磷真菌NJDL-03和NJDL-12的溶磷效果高于溶磷細(xì)菌San8。

（2）施加不同的溶磷生物菌肥皆能促進(jìn)玉米生長，促生效果順序是NJDL-12＞NJDL-03＞San8＞Substrate＞CK，生物菌肥處理不僅改善了土壤理化性質(zhì)，同樣提高了某些功能微生物的豐度，進(jìn)而影響了根際土壤細(xì)菌群落組成。