蒙麥俠，趙志國(guó)，陳志永，崔小敏

1.陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003),2.西安市碑林區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安 710002)

主題詞 色譜法，高壓液相 正交試驗(yàn) 提取工藝 丹郁消癖顆粒

丹郁消癖顆粒處方來源于臨床乳腺專科大夫多年用于治療乳腺增生病(Hyperplasia of mammary gland,HMG)的經(jīng)驗(yàn)方。HMG是一種非炎癥又非腫瘤的良性乳腺疾病，是臨床常見的乳房疾病，該病好發(fā)于25～50歲的中青年婦女，發(fā)病率在育齡婦女中占40%左右，約占乳腺病的75%，居乳房疾病首位。隨著城市生活節(jié)奏加快、社會(huì)壓力增大、女性生活角色的轉(zhuǎn)變以及生育情況的影響，發(fā)病率呈逐年提高。乳腺增生分為典型性和非典型性增生，后者被業(yè)內(nèi)專家視為乳腺癌癌前病變的高度可疑信號(hào)[1-3]，因而引起相關(guān)醫(yī)學(xué)及女性朋友的普遍關(guān)注。

該藥處方由柴胡、丹參、益母草、赤芍、郁金、香附、莪術(shù)等藥味組成，具有疏肝理氣、活血化瘀，軟堅(jiān)散結(jié)之功，對(duì)肝郁氣滯、痰瘀互結(jié)型乳腺增生有很好的療效。乳腺增生病臨床多以3個(gè)月為1個(gè)治療周期，此方目前以湯劑形式用于臨床，給患者帶來服用量大、攜帶保存不便、依從性差、不能滿足長(zhǎng)時(shí)間服用等缺點(diǎn)，故確定結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)手段將其制成無糖型顆粒劑。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中以君藥丹參中活血化瘀有效成分丹參素鈉的轉(zhuǎn)移率和干膏率為綜合考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選丹郁消癖顆粒的水煎提取工藝參數(shù)，為今后的規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

儀器與材料

1 儀 器 LC-2010A HT型高校液相色譜儀(島津公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT 25S型電子分析天平(d=0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；溫控式電熱套(1000、2000 ml，鞏義市英峪予華儀器廠)。

2 材 料 丹參素鈉(批號(hào)：110855-201412)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；丹參、益母草、赤芍、郁金、柴胡等藥材均購(gòu)自陜西興盛德藥業(yè)責(zé)任有限公司，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院中藥鑒定與炮制研究室蒙麥俠副研究員鑒定均符合2015版中國(guó)藥典規(guī)定；甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

方法與結(jié)果

1 浸泡時(shí)間與吸水倍數(shù)考察 取試驗(yàn)處方量藥材，加適量水至液面高出藥材1 cm為止，記錄加入水的體積，總量為藥材量的6倍，每間隔一定時(shí)間觀察一次浸泡程度，待全方藥物浸透無干芯為止，記錄浸泡時(shí)間后，藥液濾過至盡，記錄傾出液體積。試驗(yàn)結(jié)果表明：浸泡時(shí)間為1 h，吸水倍數(shù)為1.3倍，由此確定正交試驗(yàn)加水倍數(shù)定為6、8、10倍。

吸水倍數(shù)=(加入水體積-傾出液體積)/藥材量

2 丹參素鈉含量測(cè)定[4-6]

2.1 溶液的制備：對(duì)照品溶液制備取丹參素鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.151 mg的溶液，即得。

供試品溶液制備：按處方量稱取赤芍、柴胡、益母草、莪術(shù)等藥材，置回流提取器中，按文中表2安排的試驗(yàn)方案回流提取，提取液濾過，合并，濃縮至500 ml，精密量取各項(xiàng)下濃縮液50 ml，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解并轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，超聲處理30 min，放冷，定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

陰性樣品溶液制備：稱取處方量除丹參外的剩余藥材，加10倍量水煎煮3次，每次2 h，提取液濾過，合并，其余同供試品溶液處理方法處理，制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性：色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%冰醋酸溶液(7∶93)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；理論塔板數(shù)：按丹參素鈉計(jì)不低于3000。

系統(tǒng)適用性:在上述色譜條件下吸取丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果陰性樣品色譜圖顯示在丹參素鈉出峰位置無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，供試品色譜圖顯示丹參素鈉色譜峰和相鄰峰達(dá)到基線分離，表明選用的色譜條件適宜，陰性樣品對(duì)丹參素鈉的測(cè)定無干擾，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.3 測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算丹參素鈉含量，即得。

3 干膏率的測(cè)定 精密量取2.1項(xiàng)下的濃縮液50 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，參照《中國(guó)藥典》2015版四部2201之浸出物測(cè)定法，在105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱定重量，再干燥0.5 h，同前法放置及稱定重量，計(jì)算是否干燥達(dá)到恒重，否則，繼續(xù)干燥0.5 h，直至恒重，計(jì)算干膏重及提取干膏率。

干膏率=干膏重×10÷煎煮藥材量

4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7-8]在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取加水量、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)為考察因素，以干膏率和丹參素鈉含量為考察指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗(yàn)表。按處方量稱取藥材，共9份，照表1因素水平表和表2正交實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，藥材加規(guī)定量水浸泡1 h后，提取相應(yīng)時(shí)間和次數(shù)，合并提取液，濾過，濃縮至500 ml后按照上述測(cè)定方法測(cè)定丹參素鈉含量和干膏率。正交試驗(yàn)因素水平見表1，干膏率方差分析見表2，丹參素鈉含量方差分析見表3，正交實(shí)驗(yàn)安排和數(shù)據(jù)分析見表4。

A-丹參素鈉標(biāo)準(zhǔn)品 B-供試品溶液 C-缺丹參陰性樣品溶液

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 干膏率方差分析表

注：F0.1(2，2)=9.00 F0.05(2，2)=19.00 F0.01(2，2)=99.00

表3 丹參素鈉含量方差分析表

注：F0.1(2，2)=9.00,F0.05(2，2)=19.00,F0.01(2，2)=99.00

從表2和表3數(shù)據(jù)可以得出：以干膏率為考察指標(biāo)，煎煮次數(shù)的影響有極顯著性影響意義，該因素的水平不可調(diào)整，加水量及提取時(shí)間的影響無顯著性意義；以丹參素鈉為考察指標(biāo)，加水量和煎煮次數(shù)對(duì)其提取量有影響，但沒有顯著性意義。綜合直觀及方差分析結(jié)果，確定最佳提取工藝為A3B3C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

5 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取處方量藥材，三份，加水浸泡1 h，加10倍量水，煎煮3次，每次2.0 h，煎煮液合并，濾過，濃縮至500 ml，下按“干膏率和丹參素鈉測(cè)定”方法進(jìn)行，計(jì)算干膏率和丹參素鈉含量，結(jié)果見表5，平均干膏率為26.85%，RSD為1.30%，丹參素鈉平均含量為146.61mg，RSD為2.06%，說明優(yōu)選工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。

表4 正交試驗(yàn)安排和數(shù)據(jù)分析表

從表4數(shù)據(jù)直觀分析可以得出各因素對(duì)干膏率的影響依次為：C>A>B，即煎煮次數(shù)>加水量>煎煮時(shí)間；對(duì)丹參素鈉提取量的影響依次為：A>C>B，即加水量>煎煮次數(shù)>煎煮時(shí)間；最優(yōu)工藝為：從干膏率考察指標(biāo)得出加10倍量水，煎煮2.0 h，煎煮3次；從丹參素鈉考察指標(biāo)得出加10倍量水，煎煮2.0 h，煎煮3次；兩者優(yōu)選出的結(jié)果一致。從直觀分析最終確定最優(yōu)提取工藝為：A3B3C3，即加10倍量水，煎煮3次，每次2 h。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

討 論

乳腺增生病是一種乳腺組織非炎性又非腫瘤的良性乳腺疾病?；颊咭匀橄倌[塊和脹痛為主要癥狀，是乳腺主質(zhì)或間質(zhì)不同程度地增生與復(fù)舊不全，造成乳腺結(jié)構(gòu)在數(shù)量及組織形態(tài)上表現(xiàn)異常的一類疾病，是以腺泡上皮、導(dǎo)管上皮及纖維結(jié)締組織增生為主要病理改變的乳房疾病。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺增生病主要由外界不良因素如長(zhǎng)期的精神緊張、過度勞累及晚婚晚育等而致使機(jī)體內(nèi)分泌紊亂所致，如雌二醇絕對(duì)或相對(duì)增高，孕酮分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，導(dǎo)致E2/P比例失調(diào)，孕酮失去制約雌二醇與保護(hù)乳腺組織的作用，致使雌激素持續(xù)對(duì)乳腺組織不良刺激，從而引起乳腺增生病。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病屬于中醫(yī)的乳癖范疇，主要由人體臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、津液、陰陽失調(diào)而引起的生理功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的一類疾病。乳房位于胸中，為“宗經(jīng)之所”；其中，足陽明胃經(jīng)(乳中穴)貫乳中；足厥陰肝經(jīng)上貫膈，布胸肋，繞乳頭；足少陰腎經(jīng)從腎上貫肝膈，入肺中，支脈入胸中而與乳聯(lián)；足太陰脾經(jīng)上貫膈，經(jīng)于乳外測(cè)；任脈行于兩乳之間，沖脈挾臍上行，至胸中而散。因此生理上乳房受臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血、津液所養(yǎng)，在“腎-天癸-沖任”性軸的協(xié)調(diào)作用下完成各項(xiàng)生理功能。因此乳腺增生的發(fā)病與肝、脾、胃、腎經(jīng)及沖任二脈關(guān)聯(lián)最為密切，上述臟腑經(jīng)絡(luò)功能失調(diào)皆可治病。歷代中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為該病的病機(jī)主要責(zé)之于肝氣郁結(jié)、脾虛痰阻、腎陽不足、沖任失調(diào)，進(jìn)而會(huì)使機(jī)體形成氣滯、痰凝、血瘀等癥狀。病位在肝脾腎，病性是本虛標(biāo)實(shí)，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)因虛致實(shí)、因?qū)嵍?、虛?shí)夾雜的復(fù)雜過程[9-10]。丹郁消癖顆粒處方重用活血理氣通絡(luò)之品，使患者氣滯可解，淤血可化，經(jīng)絡(luò)可暢，故活血化瘀藥在該方中起著重要作用。

丹參為丹郁消癖顆粒方中君藥，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功，用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕積聚、胸腹疼痛等；文獻(xiàn)資料[11-15]報(bào)道所含水溶性成分丹參素具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，抗血小板凝聚、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成，促進(jìn)血管新生等作用，對(duì)于改善乳腺增生瘀血癥狀發(fā)揮重要療效，故工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)中對(duì)丹參素鈉含量和干膏率雙重指標(biāo)給以評(píng)價(jià)。工藝考察結(jié)果中分別以丹參素鈉和干膏率計(jì)算，優(yōu)選出的最佳提取工藝參數(shù)方向性一致，故未采用分值比來計(jì)算。最后綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定提取工藝為處方藥材加10倍量水、浸泡1 h、提取3次，每次2 h，經(jīng)驗(yàn)證表明優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行。