盛家峰,李曉霞，張海濤

河南省漯河市第二人民醫(yī)院藥劑科(漯河462000)

主題詞 色譜法，高壓液相 @多元指紋圖譜 @復(fù)方銀杏通脈膠囊 @質(zhì)量評價(jià)

隨著我國人口老齡化的加劇，人體自身身體機(jī)能的衰退導(dǎo)致多數(shù)老齡化人口的主要威脅性疾病有心血管疾病、腦血管疾病等。結(jié)合中醫(yī)辨證論治，老年人多以肝腎脾虛為本，血瘀為標(biāo)，中醫(yī)藥在防治心腦血管疾病方面積累了豐富的臨床治療經(jīng)驗(yàn)，無論治標(biāo)的活血化瘀還是治本的補(bǔ)肝益腎均在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中有很大進(jìn)展，其中復(fù)方銀杏通脈的主要功效是滋補(bǔ)肝腎，健脾通脈，臨床上用于治療活血消栓，理氣止痛，用于冠心病、心絞痛、腦動脈硬化、高血脂癥、中風(fēng)及其后遺癥[1-3]。臨床上復(fù)方銀杏通脈的制劑類型只有口服液，無法滿足部分患者更傾向于服用膠囊的需求，而復(fù)方銀杏通脈中以銀杏葉為君藥，活血通脈，促進(jìn)血液循環(huán)，丹參和川芎為臣，助君藥活血行氣，安撫腦神經(jīng)；佐藥三七助君臣活血通脈，黃芪補(bǔ)益肝腎脾之氣，元陽充溢，氣行血行，全方共奏補(bǔ)益肝腎，健脾通脈之效?；诖?，本課題組研究制備復(fù)方銀杏通脈膠囊，以滿足患者不同服藥需求，提高患者按時(shí)服用的依從性，現(xiàn)將復(fù)方銀杏通脈膠囊的制備及質(zhì)量評價(jià)研究詳細(xì)報(bào)道如下。

儀器與試藥

1 儀 器 液相色譜儀(型號:LC-4100，廠家：滕州市艾倫分析儀器有限公司);精密電子秤(型號: FA2004C，廠家：蘇州奇樂電子科技有限公司);薄層板涂布器(型號：VF2162，廠家：荷蘭TQC)。

2 試 劑 由Fisher scientific公司提供的甲醇(批號LOT:111280)和乙腈(批號LOT:096328);中國食品藥品檢定研究院提供的超純水、銀杏葉提取物對照品(21576-1028279)和丹參酮Ⅱ A對照品(71728-110766)。

3 分析樣品 復(fù)方銀杏通膠囊的研制[4]：處方：銀杏葉、丹參各200 g，三七20 g，川芎160 g，黃芪65 g，由我院中藥房提供，以上銀杏葉和三七分別研磨成粗粉，銀杏葉粉精密稱取50 g與三七粉混合待用，其余銀杏葉粉末加5倍量90%乙醇浸泡3 d獲得第一次銀杏葉濾過液，銀杏葉粉末藥渣再加入5倍量60%乙醇浸泡2 d，獲得第二次銀杏葉濾過液，混合2次銀杏葉濾過液回收乙醇獲得銀杏葉醇提取液，銀杏葉粉末藥渣再加入5倍量水煮沸1 h，濾過合并銀杏葉醇提液，并將其濃縮至稠膏狀(相對密度為1.30～1.35，檢測溫度50℃)；丹參、川芎和黃芪常規(guī)浸泡煎煮，熬取兩次濾過煎煮液并混合，濾過并將其濃縮至稠膏狀(相對密度為1.30～1.35，檢測溫度50℃)；混合所有稠膏和粉末，減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入適量糊精，混勻，制粒，烘干并裝膠囊(1號，0.3g/粒)，共制成膠囊1000粒，即得復(fù)方銀杏通脈膠囊。

方法與結(jié)果

1 色譜條件 以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：檢測波長為265nm：柱溫為35℃。

2 對照品溶液的制備 精密稱取銀杏葉提取物對照品，加水制成每1 ml含48μg的對照溶液；精密稱取丹參酮ⅡA對照品，加甲醇制成每1 ml含有10 μg的對照品溶液；將兩種對照品溶液混合獲得混合對照品溶液。

表1 流動相洗脫梯度

3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方銀杏通脈膠囊的內(nèi)容物1.0 g，加入含有20 ml甲醇的錐形瓶中，塞緊瓶口，充分搖勻，稱重并記錄，在500 W功率和40 KHz頻率下超聲處理30 min后，冷卻稱重并記錄，重量與第一次記錄進(jìn)行對比并以甲醇補(bǔ)齊致等重，搖勻后采用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾過液即為供試品溶液。

4 專屬性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用薄層層析的方法對復(fù)方銀杏通脈膠囊進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示如圖1，復(fù)方銀杏通脈膠囊專屬性良好。

5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品的甲醇溶液(0.1072mg/ml)3.0、6.0、12.0、18.0、24.0ml，分別置50ml量瓶中。加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積；以混合對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=2581530.89X-12670.48，r=0.9999(n=5)，結(jié)果表明，混合對照品在0.06432～0.1456μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 線性關(guān)系考察

6 中間精密度試驗(yàn) 精密吸取10μl同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果顯示相對標(biāo)注偏差RSD是0.83%，精密度良好。

7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取10 μl同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進(jìn)樣檢測，結(jié)果顯示48 h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定，RSD是1.05%。

8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取10 μl同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測5次，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.80%，重復(fù)性良好。

9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取6份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 ml混合對照品甲醇溶液(0.00536 mg/ml)，進(jìn)行回收率試驗(yàn)測定，計(jì)算結(jié)果顯示平均回收率為99.07%，RSD為0.75%， 見表3。

表3 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果

10 樣品測定結(jié)果

10.1 多元指紋圖分析：精密稱取三批樣品進(jìn)行多元指紋圖譜分析，結(jié)果顯示銀杏葉提取物RSD為3.81%，丹參酮ⅡA的RSD為4.96%，見圖2。

10.2 復(fù)方銀杏通脈膠囊制劑檢查項(xiàng)目測定：根據(jù)《中國藥典》[5]中對膠囊制劑水分、裝量差異和崩解時(shí)限進(jìn)行檢查，結(jié)果如表4所示，均符合國家相關(guān)規(guī)定。

表4 復(fù)方銀杏通脈膠囊制劑檢查項(xiàng)目測定結(jié)果

10.3 重金屬和砷鹽的超標(biāo)檢驗(yàn)：重金屬超標(biāo)檢測中取2g復(fù)方銀杏通脈膠囊內(nèi)容物，在恒重坩堝中慢慢熾熱至完全炭化，溫度大約升高到500℃～600℃，內(nèi)容物完全灰化后并至恒重，結(jié)果顯示三批樣品重金屬含量均小于10 ppm；砷鹽檢測中取1 g復(fù)方銀杏通脈膠囊內(nèi)容物，加入少量水和1 g氫氧化鈣后混勻并干燥，同重金屬檢測相似先小火炭化再高溫灰化，灰化后冷卻加少量水和5 ml鹽酸并至恒重，結(jié)果顯示三批樣品砷鹽含量均小于2 ppm，見表5。

表5 重金屬和砷鹽的超標(biāo)檢驗(yàn)

討 論

本論文研究了治療冠心病輕度腦動脈硬化的中藥新制劑——復(fù)方銀杏通脈膠囊，本課題組通過近幾年比較系統(tǒng)的文獻(xiàn)梳理工作和反復(fù)試驗(yàn)研究工作，完成了復(fù)方銀杏通脈膠囊制劑工藝的研究、指紋圖譜檢測方法可行性的研究以及復(fù)方銀杏通脈膠囊的質(zhì)量評價(jià)研究，取得了預(yù)期效果。

1 建立了制劑工藝方法

1．1 以處方君藥銀杏葉中銀杏葉提取物和臣藥丹參中的丹參酮ⅡA的含量為考察指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)法優(yōu)選出銀杏葉合并醇提的工藝條件，與丹參、川芎、黃芪合并水提的工藝條件，混合銀杏葉粉末和三七粉末。不斷重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，表明此復(fù)方銀杏通脈膠囊的工藝穩(wěn)定性和可行性良好[6-7]。

1．2 確定了膠囊劑最佳成型工藝條件為：采用減壓干燥，粉碎成細(xì)粉，加入適量糊精混勻幫助賦形，用85%乙醇濕法制粒，烘干并裝1號膠囊[8]。

2 建立了制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制方法

2．1 藥物質(zhì)量安全性控制方法：為控制復(fù)方銀杏通脈膠囊的生產(chǎn)質(zhì)量的安全性，采用薄層色譜法結(jié)合處方藥味所含化學(xué)成分及藥理學(xué)活性，對方中的君藥和臣藥均進(jìn)行了有效復(fù)方銀杏通脈膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究。薄層色譜法對銀杏葉中的銀杏葉提取物、丹參中的丹參酮IIA等進(jìn)行了定性鑒別，顯示3批不同的測試樣本的色譜斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，空白均無出現(xiàn)干擾[9-10]；同時(shí)研究人員按照《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，對復(fù)方銀杏通脈膠囊制劑的水分、裝量差異、崩解時(shí)限進(jìn)行了檢查，其結(jié)果完全符合《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定；進(jìn)一步測定了重金屬、砷鹽的含量結(jié)果均遠(yuǎn)小于規(guī)定限度；綜上本研究顯示，復(fù)方銀杏通脈膠囊質(zhì)量安全性較高。

2．2 采用多元指紋圖譜分析進(jìn)行定量控制方法：應(yīng)用多元指紋圖譜分析測定了復(fù)方銀杏通脈膠囊制劑中銀杏葉提取物、丹參酮IIA的含量，基于前期研究條件如色譜洗脫梯度、線性考察和樣品回收率等方法的反復(fù)試驗(yàn)確認(rèn)，顯示多元指紋圖譜是一種方法簡便，且具有高靈敏度、高重復(fù)性和較強(qiáng)的專屬性強(qiáng)的一種研究方法[11]。回歸方程y=2581530.89X-12670.48，r=0.9999(n=5)，結(jié)果表明，混合對照品在0.06432-0.1456ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均回收率為99.07%，RSD為0.75%。

3 結(jié) 論 本研究采用多元指紋圖譜分析從定性到定量多指標(biāo)、全方位質(zhì)量控制方法研究復(fù)方銀杏通脈膠囊。制劑由五味藥組成，制訂了薄層色譜鑒別研究其專屬性進(jìn)行定性質(zhì)量評價(jià)[12]；合理的制訂定量質(zhì)量評價(jià)研究方法，多元指紋圖譜分析，結(jié)果顯示復(fù)方銀杏通脈膠囊中銀杏葉提取物RSD為3.81%，丹參酮ⅡA的RSD4.96%。本研究所建立的方法準(zhǔn)確性，簡易性和可操作性均較強(qiáng)，不僅有利于臨床應(yīng)用，同時(shí)對相關(guān)品種的質(zhì)量控制起到借鑒作用。