董小娜 陳澤慧 毛林強(qiáng) 王明新 張文藝

摘 要：

以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受試對(duì)象，考察了從太湖土著激蕩魚內(nèi)臟中篩選的溶藻菌R1菌（Lysinibacillus macroides）的溶藻特性，通過chla測(cè)定、三維熒光技術(shù)，采用高溫處置、酸堿處置、透析處置手段，HPLC分離技術(shù)，考察了溶藻效果、溶藻產(chǎn)物、溶藻機(jī)制及溶藻活性物質(zhì)。結(jié)果表明：菌株R1具有較強(qiáng)的溶藻特性，10 d內(nèi)chla含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率達(dá)82.64%；采用熒光強(qiáng)度表征溶藻率，10 d溶藻率達(dá)89.80%，與chla表征的溶藻率82.64%相近；R1溶藻活性物質(zhì)是細(xì)菌分泌的胞外耐高溫類物質(zhì)，為小分子物質(zhì)（Mr<500 da），具有耐酸性堿性；熒光圖譜EMMs結(jié)合平行因子PARAFAC模型譜分析顯示溶藻過程中色氨酸增加，腐殖酸大量減少；主要溶藻產(chǎn)物為長波類類色氨酸類物質(zhì)，主要為細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)；推測(cè)溶藻活性物質(zhì)疏水性氨基酸（hydrophbic acid）；通過HPLC分離技術(shù)，從R1粗提液中分離出1餾分溶藻活性物質(zhì)，成分還需要進(jìn)一步的鑒定。

關(guān)鍵詞：

溶藻細(xì)菌；銅綠微囊藻；熒光圖譜；平行因子模型；溶藻機(jī)制

中圖分類號(hào)：X703；S182

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：16744764（2018）05011707

收稿日期：20171113

基金項(xiàng)目：

國家自然科學(xué)基金（41571471），江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（16KJB610001），江蘇省及常州市科技項(xiàng)目（BE2016653、CE20175009）

作者簡介：

董小娜（1992），女，主要從事環(huán)境工程水處理研究，Email： 170856287@qq.com。

張文藝（通信作者），男，博士，教授，Email： zwy@cczu.edu.cn

Received：20171113

Foundation item：

National Natural Science Foundation of China（No. 41571471），University Natural Science Research Project in Jiangsu Province（No. 16KJB610001）， Science and Technology Project of Jiangsu Province and Changzhou City（No. BE2016653，No.CE20175009）

Author brief：

Dong Xiaona（1992）， main research interests： water treatment and environmental engineering， （Email）： 170856287@qq.com.

Zhang Wenyi（corresponding author），PhD，professor， （Email）：zwy@cczu.edu.cn.

Algicidal characteristics of algicidal bacteria R1

Dong Xiaona， Chen Zehui， Mao Linqiang，Wang Mingxin， Zhang Wenyi

（College of Environmental & Safety Engineering， Changzhou University， Changzhou 213164，Jiangsu，P.R，China）

Abstract：

Microcystis aeruginosawas used as the experimental subject to examine the algaelysing characteristics of algicidal bacteria R1（Lysinibacillus macroides） ，which was isolated and purified from Taihu fish innards， named Surf fish. The ability of algaelysing， the degradation products， algaelysing mechanism and active algicidal substances were studied with the measurement of chlorophyll a and the three dimensional fluorescence technology， the whole experimental process was carried out through high temperature treatment， acid and alkali treatment， dialysis treatment and HPLC separation technique. The results show that the strain R1 can remove Microcystis aeruginosa effectively. The contents of chla decrease from 205.11 mg/L to 35.61 mg/L in 10 days， with degradation rate of 82.64%. The degradation rate is 89.8% measured by 3D flurescence technology in 10 d， which is similar to the result measured by measuring Chlorophylla. The fluorescence spectrometric analysis shows that the tryptophan increases and the humic acid decreases significantly. The main dissolved algal products are longwave class tryptophan， which are mainly intracellular substances.The soluble alga may be hydrophobic acid. The active algaelysing substances produced by R1 with molecular weight less than 500 da， are identified as bacteria secretion， could resist acid and be promoted in alkaline conditions. Active substance was separated from R1 crude extract by HPLC，and a further identification was necessary to be processed.

Keywords：

algicidal bacteria； microcystis aeruginosa； fluorescence spectrum； PARAFAC mode； algicidal mechanism

每年夏秋季一些水體均發(fā)生有害藻華（HAB）暴發(fā)，給水環(huán)境生態(tài)帶來極大威脅，探索行之有效的溶藻方法迫在眉睫。利用溶藻菌（algicidal bacteria）溶藻安全高效，具有廣闊前景。近年來，學(xué)者們?cè)谌茉寰暮Y選、溶藻活性代謝產(chǎn)物分析、溶藻微生物的溶藻機(jī)理等方面的研究相當(dāng)活躍，包括溶藻菌株的分離鑒定、溶藻性質(zhì)的描述、溶藻方式的探討、溶藻活性物質(zhì)的分離與純化[12]以及溶藻機(jī)理的研究等。尤其溶藻機(jī)理的研究更是深入到基因水平（分子水平）：藻細(xì)胞的細(xì)胞水平[34]、功能酶和蛋白水平[56]等。近年來溶藻菌的篩選成果頗多[7]，已分離鑒定出來的菌屬有粘細(xì)菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等[8]，因藻類的暴發(fā)與溶藻菌的生長息息相關(guān)，這些溶藻菌多來自藻華頻繁暴發(fā)地帶。細(xì)菌溶藻方式主要有2種：直接溶藻與間接溶藻，見諸報(bào)道的溶藻菌多具有間接溶藻特性[9]。對(duì)溶藻能力的測(cè)定方法有：藻細(xì)胞數(shù)量的變化、chla含量的變化及其采用藻膽蛋白（某些藻類如藍(lán)藻）的含量變化等。對(duì)溶藻機(jī)理的研究越來越多，眾多分析方法被用于揭示溶藻產(chǎn)物溶藻機(jī)理，如：傅里葉紅外光譜、熒光光譜、透射電鏡等[10]。細(xì)菌分泌的物質(zhì)（如氨基酸、抗生素、多肽等）[11]成分復(fù)雜，不同的溶藻菌分泌有效溶藻成分也不盡相同，這讓溶藻活性物質(zhì)的分離純化非常困難，目前分離純化出有效溶藻物質(zhì)罕見報(bào)道。報(bào)道的溶藻活性物質(zhì)的分離純化主要有2種方法：硅膠柱層析[12]與高效液相色譜（HPLC）方法[13]。對(duì)活性物質(zhì)的鑒定方法有液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）[13]、液相二級(jí)質(zhì)譜（LCMSMS）等。但這還僅僅只是限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，在實(shí)踐中直接利用的效果并不理想，其活性物質(zhì)的分離純化困難且收集率低，這使得生物菌劑投產(chǎn)與使用都難以實(shí)現(xiàn)。

采用三維熒光技術(shù)對(duì)藻膽蛋白的測(cè)定來表征溶藻效果，借助三維熒光光譜解析溶藻降解產(chǎn)物；通過對(duì)菌液進(jìn)行熱處置、破碎處置、酸堿處置、透析處置等手段研究了菌株R1 Lysinibacillus macroides的溶藻機(jī)理；并通過HPLC技術(shù)初步分離提取了有效溶藻物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 藻種來源：銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所。

菌種來源：從太湖激浪魚內(nèi)臟（魚鰓、魚腸等）中篩選出了1株溶藻效果較佳的菌株R1，培養(yǎng)2 d后，菌落呈圓形，直徑大約1～2 mm，白色，表面光滑，微微凸起，邊緣光滑，生長快速；革蘭氏染色呈紫色，為陽性菌（如圖1），經(jīng)生理生化及16S rDNA序列分析，其與Lysinibacillus macroides相似性最高，達(dá)99.50%。

圖1 R1革蘭氏染色

Fig.1 Gram's stain of R1[]

1.1.2 主要儀器和試劑 1）試劑：試劑均為中國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2）儀器：離心機(jī)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、倒置顯微鏡、島津紫外分光光度計(jì)UV1800、Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)等。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他試劑 LB培養(yǎng)基[14]、銅綠微囊藻培養(yǎng)基BG11[15]

1.2 方法

1.2.1 菌株溶藻能力考察 為探索菌株R1的溶藻效果，取10 mL培養(yǎng)24 h的R1菌液接種到100 mL銅綠微囊藻溶液中（初始chla含量為20511 mg/L），27 ℃、光暗比12 h∶12 h周期下培養(yǎng)，每天定期手動(dòng)搖晃2～3次，每隔2 d測(cè)得chla含量變化，通過式（1）[16]計(jì)算溶藻率并繪制曲線，同時(shí)做空白對(duì)照。

η=（Cc-Ct）/Cc×100%（1）

式中：η為溶藻率，%；Cc為初始chla含量，mg/L；Ct為后期chla含量，mg/L。

1.2.2 三維熒光考察溶藻效果

通過測(cè)定chla含量的方法考察溶藻效果較為繁瑣，測(cè)定時(shí)間較長，且需要耗費(fèi)許多提取物；使用顯微鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)數(shù)量是最傳統(tǒng)的浮游藻類分析方法，該方法工作量大，比較繁瑣，且有時(shí)辨別不清[17]。銅綠微囊藻有很強(qiáng)的熒光特性的藻膽蛋白，是一種卟啉類色素蛋白，卟啉具有π電子結(jié)構(gòu)[9]，在特定的波長照射下有很強(qiáng)的熒光反應(yīng)。熒光光譜分析方法快速、準(zhǔn)確、樣品不需要特別處置、簡單高效。銅綠微囊藻細(xì)胞具有如下熒光特性：藻密度與發(fā)射波長無關(guān)[18]，在低濃度下，熒光強(qiáng)度與溶液濃度成正比，可進(jìn)行定量分析[1820]。

為表征菌株溶藻過程，對(duì)菌藻混合液（參照121）進(jìn)行了三維熒光譜圖分析，取菌藻混合液，進(jìn)行三維熒光掃描，發(fā)射波長（簡稱Em）280～900 nm/280～550 nm，激發(fā)波長（簡稱Ex）220～800 nm/220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；

每隔一段時(shí)間收集混合液測(cè)Em為650 nm的三維熒光光譜，通過式（2）[21]計(jì)算溶藻率并繪制曲線。

η=（Fc-Ft）/Fc×100%（2）

式中：η為溶藻率，%；Fc為藻膽蛋白初始光強(qiáng)，A.U；Ft為后期藻膽蛋白的光強(qiáng)，A.U。

1.2.3 三維熒光圖譜EMMs結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物

為表征菌株溶藻產(chǎn)物，對(duì)降解后的藻液進(jìn)行了三維熒光譜圖分析，發(fā)射波長（簡稱Em）280～550 nm，狹縫寬度為2 nm；激發(fā)波長（簡稱Ex）220～400 nm；狹縫寬度為5 nm；同時(shí)，考察純?cè)逡杭捌渚旱臒晒馓匦浴EMs分析物質(zhì)鑒定，主要采用目視鑒定，無法避免光譜重疊帶來的誤差且具有主觀性。采用三維熒光圖譜結(jié)合平行因子分析考察溶藻產(chǎn)物：1）數(shù)據(jù)預(yù)處理：并用Delauay三角形內(nèi)插值法瑞利散射及拉曼散射。2）平行因子分析：平行因子算法是基于三線性分解理論，采用交替最小二乘原理，進(jìn)行迭代的三維數(shù)陣分解算法?？梢詫⒁粋€(gè)由多個(gè)三維熒光光譜矩陣分解為3個(gè)方向的載荷矩陣。通過對(duì)半檢驗(yàn)法（splithalf analysis），殘差平方和的最小，及核一致性檢驗(yàn)來確定模型的有效性。采用MATLAB軟件中的Nway toolbox運(yùn)行[2224]。

1.2.4 菌株的溶藻特性

為探討溶藻細(xì)菌的溶藻機(jī)制，將培養(yǎng)24 h溶藻細(xì)菌R1培養(yǎng)液進(jìn)行如下處理：

1）離心過濾上清液（8 000 r/min，10 min；過022 μm濾膜）、高熱處理上清液（121 ℃，20 min）、菌體破碎液（取離心后的菌體沉淀超聲波破碎）[16]。

2）酸堿化處置[12]：為考察pH對(duì)溶藻物質(zhì)活性的影響，分別調(diào)節(jié)菌液pH為4、7、10，處置1 h后調(diào)回中性，同時(shí)做不加菌的空白對(duì)照，接菌量為10%（體積），采用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板（biologix 24孔板）進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)，并采用顯微鏡計(jì)數(shù)法檢查溶藻效果。

3）截留分子量[12]：為考察溶藻活性物質(zhì)的分子大小，分別采用截留分子量為100、500、1 000 da的透析袋對(duì)培養(yǎng)24 h后的菌液進(jìn)行透析1 d，取透析袋中截留液于裝載銅綠微囊藻溶液的24孔板中，檢查溶藻效果。

1.2.5 溶藻活性物質(zhì)的純化與分離[13]

1）菌液前處理：接種菌株R1至500 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、135 r/min，培養(yǎng)24 h；采用045 um的濾膜過濾；收集菌液并加入4倍體積的乙醇進(jìn)行萃取，磁力攪拌30 min，后靜置2 h；使用0.22 um的濾膜過濾；收集菌液60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；無菌水重溶，4 ℃保存。

2）HPLC：通過液相色譜初步確定可能性溶藻物質(zhì)。色譜條件為：色譜柱wonda sil C18（4.6×250 mm），流動(dòng)相A（甲醇）∶B（1%乙酸）為1∶9，檢測(cè)波長為UV200 nm。

3）為考察這幾個(gè)物質(zhì)是否含有溶藻活性物質(zhì)，每隔一段時(shí)間收集1餾分，氮?dú)獯蹈?，超純水重溶，并采?4孔板進(jìn)行溶藻效果檢驗(yàn)。對(duì)有溶藻活性的收集液，再次使用HPLC檢查其純度及其峰值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株R1的溶藻能力

將R1菌液到銅綠微囊藻溶液中（初始chla為205.11 mg/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過肉眼觀察顏色變化及chla含量測(cè)定檢驗(yàn)溶藻效果，如圖2。實(shí)驗(yàn)4 d后，肉眼可見混合液發(fā)生黃化現(xiàn)象，chla含量不斷減少，10 d后剩余chla含量僅為35.61 mg/L，降解率達(dá)82.64%；同時(shí)觀察到空白樣顏色更加深綠，經(jīng)測(cè)定chla含量，從初始205.11 mg/L增長到324.56 mg/L。

2.2 三維熒光分析R1溶藻能力

取0、3、7、10、12 d的菌藻混合液進(jìn)行三維熒光光譜掃描并分析，如圖3。溶藻過程中藻膽蛋白熒光峰Em/Ex為650 nm/630 nm，熒光光強(qiáng)不斷減少。為表征其溶藻效果，通過固定Em為650 nm，將得到的熒光光譜減去去離子水的熒光光譜以去除瑞利散射的影響，將瑞利散射峰置零[18]，采用oringin8.6擬合得到光強(qiáng)與激發(fā)波長的關(guān)系圖，如圖4。按照式2）計(jì)算，10 d溶藻率為達(dá)89.80%，與通過chla表征的溶藻率82.64%相近，可作為溶藻細(xì)菌溶藻效率的一種評(píng)價(jià)方法。

2.3 菌株R1溶藻機(jī)制研究

1）由表1及圖5（1）看出：R1菌原液、離心上清液、高溫滅菌液都發(fā)生了明顯的黃化現(xiàn)象，溶藻效果顯著；菌體破碎液及菌體沒有溶藻效果；可見，其溶藻物質(zhì)并不是胞內(nèi)物質(zhì)，也不是菌株本身，而是細(xì)菌分泌的胞外物質(zhì)，具有耐高溫的特性，推測(cè)為非蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

2）由表2及圖5（2）看出，經(jīng)過不同處置的R1菌液都具有很強(qiáng)的溶藻效果，與空白對(duì)比，藻液均發(fā)生明顯的黃化現(xiàn)象；顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果見表2，從表中可見，藻細(xì)胞數(shù)量都明顯減少，由此可見，溶藻活性物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，具有耐酸耐堿性。

3）經(jīng)100、500、1 000 da的透析袋截留分子量后袋中截留液，顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果見表3，發(fā)現(xiàn)溶藻能力強(qiáng)弱順序依次為100 da>500 da>1 000 da，其中，1 000 da溶藻活性很低，由此可見，細(xì)菌分泌的有效溶藻物質(zhì)為小分子物質(zhì)，分子量小于500 da。

2.4 三維熒光圖譜結(jié)合平行因子模型分析R1溶藻

產(chǎn)物

菌株R1溶藻過程中，Em/Ex為400～600 nm/250～450 nm處出現(xiàn)了大面積的熒光反應(yīng)，熒光光譜不成規(guī)則的圓形，成分復(fù)雜，如圖3。分別對(duì)銅綠微囊藻分泌物、菌液及其降解后的菌藻共培液液進(jìn)行三維熒光光譜掃描，三維矩陣圖譜見圖6，分別為藻細(xì)胞產(chǎn)生的溶解性代謝性產(chǎn)物（EOM）（Em/Ex 335 nm/280 nm）、R1菌液的主要溶解性熒光組分（Em/Ex 335 nm/280 nm、Em/Ex 435～475 nm/350～380 nm、Em/Ex 475 nm/280 nm）及溶藻產(chǎn)物組分（Em/Ex 335 nm/280 nm、 Em/Ex 335 nm/230 nm）。

運(yùn)用PARAFAC模型結(jié)合EMMs圖譜對(duì)溶藻產(chǎn)物的三維熒光矩陣進(jìn)行解析，并通過殘差和最小分析法及裂半分析法，識(shí)別出溶藻混合液共含有可分為2個(gè)類型。分別為：475 nm/250～350 nm；330 nm/220～270 nm，對(duì)應(yīng)及類色氨酸類物質(zhì)[2224]。這2個(gè)成分的熒光圖譜及激發(fā)發(fā)射波長載荷見圖7。從圖中可見，2個(gè)熒光成分的激發(fā)載荷圖譜具有2個(gè)激發(fā)峰和1個(gè)發(fā)射峰，主要體現(xiàn)了長波類腐殖質(zhì)及色氨酸物，分析其溶藻過程中，長波類類色氨酸類物質(zhì)增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測(cè)出，藻細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的物質(zhì)及細(xì)胞組分大量釋放到混合液中。長波類類腐殖酸減少，根據(jù)其化學(xué)形成原理（由-COOH、-OH基團(tuán)的有機(jī)化合物合成的結(jié)果），其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，結(jié)合其分子量及極性特征猜測(cè)可能為小分子的疏水性氨基酸（hydrophbic acid）。

2.5 溶藻活性物質(zhì)的分離與純化

溶藻活性物質(zhì)的分離難度大，目前溶藻物質(zhì)的分離純化的報(bào)道目前還很少。本研究通過采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分離提純粗提液，掃描波長200 nm的色譜圖，見圖8。圖中具有多個(gè)物質(zhì)峰，可見經(jīng)前處理的菌液成分仍很復(fù)雜。每分鐘收集1餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，超純水重溶，并采用24孔板進(jìn)行溶藻效果檢驗(yàn)。其中有1餾分具有溶藻效果，見如9，其在既定條件下有個(gè)主要峰，保留時(shí)間分別為6.005。結(jié)合熒光光譜分析，結(jié)合熒光光譜分析，其屬于某種疏水性酸類。由于HPLC分離效率低，分離量極少而且成本很高，分離的餾分中仍還有其他成分，其溶藻物質(zhì)仍需進(jìn)一步分離及鑒定。

3 結(jié)論

1）從太湖土著激蕩魚內(nèi)臟中篩選的R1菌（Lysinibacillusmacroides），以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）為受試對(duì)象，10 d內(nèi)chla含量從205.11 mg/L降至35.61 mg/L，溶藻率達(dá)82.64%。高溫處置、酸堿處置、透析處置手段確定R1菌通過分泌耐高溫的非蛋白類物質(zhì)溶藻，屬于間接溶藻，且該物質(zhì)具有耐酸耐堿性，其分子量小于500 da。

2）熒光光譜能夠很好的表征銅綠微囊藻含量的變化，其熒光物質(zhì)為藻膽蛋白。溶藻過程中其強(qiáng)度不斷減少，可見藻細(xì)胞不斷被破壞，數(shù)量被不斷減少。固定Em為650 nm，通過熒光激發(fā)光譜圖對(duì)藻細(xì)胞密度進(jìn)行定量分析。通過熒光光強(qiáng)表征溶藻效果，避免了傳統(tǒng)藻類測(cè)量過程的繁瑣，具有重要意義。熒光光譜分析表明溶藻活性物質(zhì)可能為疏水性酸。溶藻過程中，長波類類色氨酸類物質(zhì)增加，為主要溶藻產(chǎn)物。根據(jù)其成分可推測(cè)出，藻細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的物質(zhì)及細(xì)胞組分大量釋放到混合液中。長波類類腐殖酸減少，根據(jù)其成分（含有-COOH、-OH基團(tuán)的有機(jī)化合物）猜測(cè)，其中可能含有迫使藻死亡的有效成分，可能為某種疏水性氨基酸（hydrophbic acid）。

3）采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分離提純粗提液（掃描波長200 nm），分離結(jié)果表明，從R1粗提液中分離出的1餾分溶藻活性物質(zhì)，其在既定條件下其出峰時(shí)間為6～8 min左右，推測(cè)其為某種酸類物質(zhì)，但這需要進(jìn)一步的分離和鑒定。

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