穆 碩，鹿 瑤，高彥祥，毛立科*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

蛋白質(zhì)乳液凝膠又稱乳化顆粒填充蛋白質(zhì)凝膠，其特點(diǎn)是蛋白質(zhì)凝膠中含有乳化的油滴。乳化油滴表面積較大，可以和凝膠網(wǎng)絡(luò)中的分子有更多的接觸，成為網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的支撐物。通過(guò)改變油滴結(jié)構(gòu)，包括粒徑大小與分布、油相結(jié)晶度等可以調(diào)節(jié)凝膠的形成過(guò)程，并影響凝膠的質(zhì)構(gòu)特性[1]。許多食品，如豆腐、香腸、奶酪、酸奶都可以歸類為蛋白質(zhì)乳液凝膠。另一方面，蛋白質(zhì)乳液凝膠可以作為食品功能因子的傳遞體系：脂溶性功能因子可以分散在油滴中，水溶性功能因子則可以分散到凝膠結(jié)構(gòu)當(dāng)中[2]。功能因子一方面受到凝膠的保護(hù)，另一方面被凝膠結(jié)構(gòu)固化，因此具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性[3]。以往針對(duì)食品功能因子傳遞體系的研究主要集中于單一功能因子或者相似極性功能因子，而對(duì)于能夠同時(shí)包埋不同極性功能因子的傳遞體系研究較少[4-5]。

許多食品體系中同時(shí)含有蛋白質(zhì)和多糖。荷電能力不同的多糖與蛋白質(zhì)相互作用各不相同，兩者共存時(shí)可以形成單連續(xù)相凝膠體系、雙連續(xù)相凝膠體系、均勻連續(xù)凝膠體系、非均勻鏈狀凝膠體系等不同微觀結(jié)構(gòu)[6-7]。但是，已有的研究主要針對(duì)體系組分和結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)凝膠體系[8]，而對(duì)含有油相和油水界面的蛋白質(zhì)乳液凝膠的研究非常有限。乳液凝膠中，多糖的存在不僅影響水相結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的凝膠過(guò)程，還影響油滴分布、界面組分和結(jié)構(gòu)[9-10]，因此多糖對(duì)乳液凝膠性能的影響機(jī)制更加復(fù)雜，需要更深入的研究。

本課題研究果膠對(duì)大豆分離蛋白乳液凝膠理化性質(zhì)及復(fù)合維生素穩(wěn)定性的影響機(jī)制。通過(guò)控制大豆分離蛋白乳狀液油滴粒徑大小、調(diào)節(jié)油滴界面組成，研究不同果膠添加量及熱處理溫度對(duì)乳狀液穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)凝膠過(guò)程（凝膠時(shí)間）及凝膠結(jié)構(gòu)（質(zhì)構(gòu)、持水性）特性的影響；通過(guò)追蹤蛋白質(zhì)乳液凝膠在貯藏過(guò)程中復(fù)合維生素含量的變化，闡釋凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)不同維生素穩(wěn)定性的影響機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（930E） 山東萬(wàn)德福公司；玉米油山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（glucono delta-lactone，GDL） 上海新洛洛食品有限公司；果膠（食品級(jí)） 北京寶得瑞公司；VE（食品級(jí)） 浙江新和成股份有限公司；D-異抗壞血酸鈉（食品級(jí)） 諸城華源生物工程有限公司；無(wú)水乙醇、碘、淀粉指示劑（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

JY 92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技公司；T25高速剪切機(jī) 德國(guó)IKA公司；NS1001L2K高壓均質(zhì)機(jī) 意大利GEA NiroSoavi公司；Zeta-sizer Nano-ZS90馬爾文激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司；LF111 LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀 德國(guó)LUM公司；AR1500流變儀 美國(guó)TA公司；TNS-Pro質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)FTC公司；3k15離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白乳狀液的制備

將定量大豆分離蛋白與去離子水混合，磁力攪拌實(shí)現(xiàn)初步分散；分散液在室溫條件下通過(guò)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲處理（400 W、5 min），促進(jìn)大豆分離蛋白的溶解；加入0.01%的疊氮化鈉防止蛋白質(zhì)腐敗；向蛋白質(zhì)水溶液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%、0.05%、0.1%、0.2%的果膠，磁力攪拌過(guò)夜使果膠充分水合并分散在溶液當(dāng)中；大豆分離蛋白-果膠混合溶液在70 ℃或80 ℃水浴中加熱30 min，利用冰浴迅速冷卻；此溶液作為乳狀液制備的水相。

水相中添加玉米油（油水相質(zhì)量比1∶4），使用高速剪切儀以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速剪切1 min制成粗乳液；再通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)（50 MPa均質(zhì)3 次）獲得乳液；所得乳液通過(guò)冰水迅速冷卻至室溫。

1.3.2 蛋白質(zhì)乳液凝膠的制備[11]

向制備的乳液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的GDL并混勻，室溫條件下靜置12 h以獲得蛋白質(zhì)乳液凝膠。當(dāng)利用乳液凝膠作為復(fù)合維生素傳遞體系時(shí)，在乳液的水相和油相中分別加入D-異抗壞血酸鈉（0.5%）和VE（1%）。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，2 種維生素的添加對(duì)乳液粒徑、穩(wěn)定性及凝膠的質(zhì)構(gòu)特性無(wú)顯著影響。

1.3.3 乳液粒徑和Zeta電位的測(cè)定

采用激光粒度儀測(cè)定乳液的粒徑與電位。取100 μL樣品于試管中，加入20 mL去離子水稀釋200 倍。測(cè)量時(shí)設(shè)定折光系數(shù)為1.450，25 ℃保溫平衡2 min。為了減少多重散射所造成的測(cè)量誤差，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.4 乳液穩(wěn)定性的測(cè)定[12]

應(yīng)用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀，通過(guò)加速分層和量化沉淀、懸浮的方法快速測(cè)定乳液的穩(wěn)定性。測(cè)量過(guò)程中，取乳液約1.8 mL注射到光徑為2 mm的樣品試管底部，平放至儀器中，使用近紅外或藍(lán)色光從側(cè)面照射樣品試管，并通過(guò)另一面的探測(cè)器接收樣品不同位置透過(guò)的光，從而得到樣品透射率分布的變化。通過(guò)測(cè)量不同時(shí)間條件下樣品的透射曲線，從而分析樣品物理穩(wěn)定性和粒子遷移過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)條件設(shè)定為溫度25 ℃，離心轉(zhuǎn)數(shù)4 000 r/min，樣品透射率的特征線每10 s記錄一次，共800 次。每次測(cè)定做一組平行。

1.3.5 凝膠時(shí)間的測(cè)定[11]

采用1.3.2節(jié)方法在流變儀平行面板上實(shí)現(xiàn)乳液向凝膠轉(zhuǎn)變，利用流變儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)凝膠形成過(guò)程中儲(chǔ)能模量和損耗模量（G’和G”）的演變過(guò)程。流變儀參數(shù)：60 mm平行面板（探頭），平板間隙1 mm，實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃。振蕩實(shí)驗(yàn)：0.5%應(yīng)變，1 Hz振蕩頻率，每10 s進(jìn)行一次測(cè)定，共測(cè)定12 h。樣品周邊涂一薄層硅油以減少測(cè)量過(guò)程中水分的蒸發(fā)。定義凝膠時(shí)間為G’-時(shí)間曲線和G”-時(shí)間曲線的交點(diǎn)。

1.3.6 蛋白質(zhì)乳液凝膠質(zhì)構(gòu)分析

采用1.3.2節(jié)方法使乳液在50 mL離心管中成膠，使用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定凝膠的硬度和彈性。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)：圓柱型柱塞探頭（直徑20 mm），在25 ℃條件下以1 mm/s的速率壓縮（形變10 mm）2 次，做3 組平行并記錄壓力-時(shí)間曲線。定義硬度為第1次壓縮時(shí)的最大峰值壓力，定義彈性為第2次壓縮中所測(cè)到的樣品恢復(fù)高度與第1次壓縮型變量之比，即樣品經(jīng)過(guò)第1次壓縮后能夠再恢復(fù)的程度。

1.3.7 貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)乳液凝膠中維生素穩(wěn)定性分析

含有復(fù)合維生素的乳液凝膠在室溫條件下貯藏12 d，每3 d測(cè)定凝膠中維生素的含量，計(jì)算維生素的包埋率，公式如下：

1.3.7.1 VE含量的測(cè)定[13]

參考GB 1886.233—2016《食品添加劑維生素E》。準(zhǔn)確稱取含VE的乳液凝膠3.0 g，加無(wú)水乙醇25 mL，攪拌，促進(jìn)VE的溶出，冷卻過(guò)濾，提取3 次合并濾液；采用分光光度計(jì)法測(cè)定在284 nm波長(zhǎng)處的濾液吸收峰；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.005 2x-0.033 5）計(jì)算濾液中VE的含量。

1.3.7.2 D-異抗壞血酸鈉含量的測(cè)定[14]

參考GB 8273—2016《食品添加劑D-異抗壞血酸鈉》的方法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取凝膠樣品5 g，加30 mL蒸餾水搗碎后水浴加熱溶解；3 600 r/min離心30 min。用注射器吸取下層清液，采用碘滴定法測(cè)定清液中D-異抗壞血酸鈉含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)2 次，每個(gè)樣品至少檢測(cè)3 組數(shù)據(jù)，結(jié)果用表示。運(yùn)用Origin 8.0軟件，采用Duncan法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，顯著水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠對(duì)乳狀液性質(zhì)的影響

乳狀液液滴大小及其分布對(duì)乳狀液的穩(wěn)定性有很大的影響[15]。根據(jù)斯托克斯規(guī)律，顆粒粒徑越小，沉淀速度越慢，乳狀液也就越穩(wěn)定。如表1所示，隨著果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加乳液的粒徑都呈上升趨勢(shì)，這可能是由于加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)與果膠形成了分子質(zhì)量更大的共價(jià)復(fù)合物，無(wú)法在均質(zhì)過(guò)程中快速吸附[16]，使得部分油滴未能被乳化劑充分覆蓋而發(fā)生聚集。而溫度越高，則越可能促進(jìn)該共價(jià)反應(yīng)的進(jìn)行。所以，復(fù)合物溶液制備的乳狀液粒徑越大。乳液Zeta電位的測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了此推論：果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，乳液界面電勢(shì)強(qiáng)度（Zeta電位的絕對(duì)值）越低；溫度升高，界面電勢(shì)強(qiáng)度減弱（表1）。盡管有研究表明，蛋白質(zhì)和多糖在帶相同電荷的情況下也可能通過(guò)靜電吸引形成非共價(jià)復(fù)合物（如通過(guò)蛋白質(zhì)的正電基團(tuán)與果膠的負(fù)電基團(tuán)）[17]，但在本體系中無(wú)法確定其影響。

表1 果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和預(yù)加熱溫度對(duì)乳液粒徑和Zeta電位的影響Table 1 Effects of pectin concentration and preheating temperature on particle size and zeta potential of emulsions

圖1 果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和預(yù)加熱溫度對(duì)乳液穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effects of pectin concentration and preheating temperatures on the stability of emulsions

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀研究不同乳液的物理穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)時(shí)通過(guò)加速離心的方法快速測(cè)定乳液的油-水分層情況，并記錄乳液各部位隨時(shí)間的透光率變化（通過(guò)澄清指數(shù)表示），變化越慢則說(shuō)明乳液的物理穩(wěn)定性越好[18]。如圖1所示，乳液體系澄清指數(shù)處于較低的水平（＜0.25），表明乳液在貯藏過(guò)程中具有良好的乳析穩(wěn)定性，不易出現(xiàn)分層現(xiàn)象。這一方面是由于體系較高的界面電勢(shì)（|Zeta電位|≥30 mV），分散相液滴間存在較大的靜電斥力；另一方面，果膠的存在使得體系黏度進(jìn)一步增大，減少了液滴碰撞形成較大液滴的幾率。但是果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，澄清指數(shù)越高，說(shuō)明蛋白質(zhì)-果膠復(fù)合物的存在使得乳液體系穩(wěn)定性有下降的趨勢(shì)[19]。

2.2 果膠對(duì)蛋白質(zhì)乳液凝膠性質(zhì)的影響

圖2 果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和預(yù)加熱溫度對(duì)乳液凝膠時(shí)間的影響Fig. 2 Effects of pectin concentration and preheating temperature on the gelation time of emulsions

加熱過(guò)程中，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開，更多的疏水基團(tuán)暴露。添加GDL后，乳液體系pH值不斷降低，蛋白質(zhì)分子荷電量減弱，使得蛋白質(zhì)分子互相交聯(lián)形成聚合物并最終形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠[20-21]。但是，果膠的存在對(duì)凝膠過(guò)程及凝膠結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生重要影響。如圖2所示，乳液體系中果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，乳液凝膠時(shí)間越短。這可能由于果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加使得體系黏度提高，可以加速凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。通常條件下，高溫處理可以促進(jìn)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開，進(jìn)而加速蛋白質(zhì)凝膠的形成[22]。但是，高溫處理過(guò)程中蛋白質(zhì)與果膠形成共價(jià)復(fù)合物，疏水基團(tuán)暴露量降低，減緩了蛋白質(zhì)凝膠的形成。

圖3 果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)和預(yù)加熱溫度對(duì)乳液凝膠儲(chǔ)能模量的影響Fig. 3 Effect of pectin concentration and preheating temperature on the storage modulus of emulsion gels

如圖3所示，由于蛋白質(zhì)-果膠復(fù)合物的形成，使得參與蛋白質(zhì)凝膠形成的有效蛋白質(zhì)含量降低。因此，果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，乳液凝膠的強(qiáng)度（儲(chǔ)能模量G’）呈減弱趨勢(shì)。同時(shí)，因溫度升高（80 ℃）而產(chǎn)生的更多暴露的疏水基團(tuán)并未完全參與蛋白質(zhì)交聯(lián)，反而是由于復(fù)合物生成量增加導(dǎo)致最終凝膠強(qiáng)度較70 ℃處理體系呈變小的趨勢(shì)，但差異不顯著。眾多研究表明，在中性pH值附近，微小的pH值變化都可能對(duì)乳清蛋白-果膠復(fù)合物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)產(chǎn)生重要影響。在pH 7條件下，乳清蛋白-果膠復(fù)合物經(jīng)85 ℃加熱30 min后形成的凝膠（由GDL誘導(dǎo)）其強(qiáng)度高于乳清蛋白單獨(dú)加熱處理后添加果膠形成的凝膠。但是在pH 6.5和pH 6.2條件下，兩類凝膠的強(qiáng)度無(wú)顯著性差異[23-24]。

圖4 果膠含量和預(yù)加熱溫度對(duì)乳狀液膠硬度（A）和彈性（B）的影響Fig. 4 Effect of pectin concentration and preheating temperature on firmness (A) and springiness (B) of emulsions

如圖4A所示，無(wú)論是果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)，還是蛋白質(zhì)-果膠溶液加熱溫度，均未對(duì)凝膠的硬度產(chǎn)生顯著性影響（P＞0.05）。這可能是由于本研究中所形成的凝膠強(qiáng)度較低（G’＜2 000 Pa），在質(zhì)構(gòu)儀分析條件下凝膠結(jié)構(gòu)被迅速破壞，無(wú)法區(qū)分出不同組分和處理?xiàng)l件下的凝膠的硬度差異。如圖4B所示，不同組分的乳液凝膠其彈性存在較大差異。一方面，經(jīng)過(guò)80 ℃熱處理的蛋白質(zhì)-果膠復(fù)合溶液其最終形成的乳液凝膠彈性較70 ℃熱處理后形成的乳液凝膠彈性更高；另一方面，凝膠彈性隨果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，蛋白質(zhì)-果膠復(fù)合物對(duì)最終凝膠的彈性有重要影響。盡管果膠的存在使得凝膠強(qiáng)度降低，但可以使凝膠彈性增強(qiáng)。

2.3 蛋白質(zhì)乳液凝膠中復(fù)合維生素穩(wěn)定性測(cè)定

傳遞體系具有改善功能因子的水（或油）分散性，增強(qiáng)功能因子穩(wěn)定性，提高生物利用率等優(yōu)點(diǎn)，是功能配料與功能食品領(lǐng)域研究的一個(gè)重要方向。近20年來(lái)，科學(xué)家針對(duì)多種功能因子傳遞體系，如乳狀液、脂質(zhì)體、生物大分子顆粒，開展了較為系統(tǒng)的研究[25-29]。但是，現(xiàn)有的食品傳遞體系主要針對(duì)脂溶性功能因子，適用于水溶性功能因子的傳遞體系并未得到深入研究，能夠同時(shí)包埋脂溶性和水溶性功能因子的傳遞體系則鮮有報(bào)道[4,30]。乳液凝膠同時(shí)包含適用于傳遞脂溶性功能因子的乳化油滴，又包含適用于傳遞水溶性功能因子的蛋白質(zhì)凝膠，因此可以被用來(lái)同時(shí)傳遞不同極性食品功能因子。本研究中利用脂溶性的VE和水溶性的D-異抗壞血酸鈉作為模式功能因子，分析乳液凝膠對(duì)復(fù)合維生素穩(wěn)定性的影響規(guī)律。

圖5 果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)貯藏過(guò)程VE穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of pectin concentration on the stability of vitamin E in emulsion gels during storage

由圖5可知，乳液凝膠中的VE含量在貯藏過(guò)程緩慢下降，其下降程度受體系組分的影響。首先，果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高的體系VE初始包埋率較低，降解速度也更快；其次，相比于經(jīng)過(guò)70 ℃加熱處理后形成的凝膠，經(jīng)過(guò)80 ℃加熱處理后形成的凝膠中VE初始包埋率和貯藏實(shí)驗(yàn)?zāi)┢赩E包埋率都較低。這是由于含有蛋白質(zhì)-果膠復(fù)合物的凝膠強(qiáng)度較弱，對(duì)VE的保護(hù)作用較低，容易受外界環(huán)境影響而發(fā)生氧化降解。

圖6 果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)貯藏過(guò)程D-異抗壞血酸鈉穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of pectin concentration on the stability of sodium erythorbate in emulsion gels during storage

如圖6所示，乳液凝膠中的D-異抗壞血酸鈉的降解規(guī)律與VE有一定的相似性，即果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的體系D-異抗壞血酸鈉包埋率越低。但是，相比于VE，D-異抗壞血酸鈉的降解速率更高。例如，在含有0.2%果膠的乳液凝膠（80 ℃處理?xiàng)l件下）中，經(jīng)過(guò)12 d貯藏后，VE包埋率約從85%下降到75%，而D-異抗壞血酸鈉的包埋率則從70%下降到40%。造成此差異的主要原因是：1）異抗壞血酸鈉主要分布在水相，與外界環(huán)境直接基礎(chǔ)，更容易受到光、熱、氧的影響；2）含有果膠的乳液凝膠強(qiáng)度較弱，持水率低，在貯藏過(guò)程中出現(xiàn)較明顯失水現(xiàn)象，導(dǎo)致部分D-異抗壞血酸鈉隨水分遷移到凝膠表面，失去凝膠的保護(hù)；3）D-異抗壞血酸鈉作為抗氧化劑，在一定程度上保護(hù)了VE。

3 結(jié) 論

果膠與大豆分離蛋白在加熱過(guò)程中形成復(fù)合物，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)乳液凝膠的結(jié)構(gòu)特性。果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，凝膠中油滴粒徑越大，凝膠時(shí)間越短，凝膠強(qiáng)度下降。此外，蛋白質(zhì)-果膠的預(yù)加熱溫度也對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。因此，通過(guò)改變果膠添加量和預(yù)加熱溫度可以有效調(diào)控乳液凝膠的結(jié)構(gòu)特性。

蛋白質(zhì)乳液凝膠可以作為復(fù)合維生素的傳遞體系，其穩(wěn)定性受凝膠結(jié)構(gòu)影響明顯。含有果膠的凝膠強(qiáng)度較低，復(fù)合維生素穩(wěn)定性隨果膠含量增加而下降，D-異抗壞血酸鈉降解速率顯著高于VE，表明水相中D-異抗壞血酸鈉作為抗氧化劑保護(hù)了油相中的VE。此外，復(fù)合維生素的穩(wěn)定性變化可能還存在一定的協(xié)同機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。