趙潔雅　夏俊　楊會國　郝耿　馬文戈　陳世軍

摘 要：以新疆某羊場疑似傳染性胸膜肺炎的綿羊為研究對象，對羊只病情和癥狀進行跟蹤記錄，對死亡羊只進行剖檢；無菌采集病料后通過綿羊支原體PCR和細(xì)菌培養(yǎng)的方法進行實驗室病原診斷。結(jié)果顯示，死亡羊只肺部發(fā)生實變、黏連、胸膜壁粗糙增厚、氣管內(nèi)有大量白色泡沫，具有典型的纖維素性胸膜肺炎的剖檢特征；此外綿羊支原體PCR檢測結(jié)果為陽性，而細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果陰性，最終確診該疫情為綿羊支原體引起的傳染性胸膜肺炎。本文通過對綿羊支原體肺炎的臨床癥狀、病理變化、實驗室診斷等方面的介紹，以期為今后該病的防控工作提供指導(dǎo)和借鑒。

關(guān)鍵詞：綿羊；支原體；診斷；防控

中圖分類號：S858.26 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.07.007

Diagnosis and Prevention of Infectious Pleuropneumonia in Sheep

ZHAO Jieya1， XIA Jun2， YANG Huiguo3， HAO Geng3， MA Wen'ge2， CHEN Shijun2

（1. College of Animal Madicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830000，China； 2.Institute of Veterinary Science， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi， Xinjiang 830000，China； 3.Institute of Animal Science， Xinjiang Academy of Animal Science， Urumqi， Xinjiang 830000，China）

Abstract： The author took the sheep suspected of infectious pleural pneumonia in a sheep farm in Xinjiang as the research object， recorded the condition and symptoms of the sheep， and dissected the dead sheep. The pathogens were diagnosed by PCR and bacterial culture. The results showed that the lungs of the dead sheep were thickened and clung， the pleural wall was coarse and thickened， there were a lot of white foams in the trachea， which had the characteristic of typical cellulose pleural pneumonia. The PCR test of mycoplasma ovis was positive，while the bacterial culture result was negative， finally confirmed that the epidemic situation was the sheep infectious pleuropneumonia caused by Mycoplasma ovis. The paper introduced the clinical symptoms， pathologic changes and laboratory diagnosis of sheep mycoplasma pneumonia in order to provide guidance and reference for the prevention and control of the disease in the future.

Key words： sheep； Mycoplasma ovis； diagnosis； prevention and control

支原體是目前已知能獨立生活的缺乏細(xì)胞壁的最小原核微生物[1]，綿羊傳染性胸膜肺炎是由綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）引起的綿羊特有的接觸性傳染病，該病原微生物由MACKEY等[2]于1963年在英格蘭首次從綿羊體內(nèi)分離得到，以后相繼在其他國家和地區(qū)均有報道[3]。GEORGE等[4]在澳大利亞昆士蘭從間質(zhì)性肺炎的綿羊中分離到了支原體，后被CARMICHAEL描述并正式命名綿羊肺炎支原體。之后在世界多個國家和地區(qū)均有該病的報道，我國四川、新疆、甘肅、河北、云南等多個省區(qū)都有該病的發(fā)生[5]。此病1～3月齡羔羊易感，以高熱、咳嗽、肺和胸膜發(fā)生漿液性及纖維素性炎癥為主要特征[6]，病變多發(fā)生于肺組織的心葉、尖葉、隔葉，病程可達數(shù)月至數(shù)年。綿羊肺炎支原體的感染一般需要通過實驗室的方法確診，但因該支原體在臨床上分離培養(yǎng)比較困難，且許多健康羊只也攜帶有低水平的綿羊肺炎支原體，因此病原分離只能作為診斷的輔助手段[7]。支原體感染對外來品種及羔羊的危害較大，可引起高的發(fā)病率和死亡率，間接損失是使羊慢性營養(yǎng)消耗、體重減輕、毛質(zhì)及毛量下降、上市推遲、繁殖率降低，并造成飼料和人力的浪費[8]，這種疫病嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的健康發(fā)展。因此，采取有效的防治措施，控制綿羊傳染性胸膜肺炎的發(fā)生和流行，對養(yǎng)羊業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和提高養(yǎng)殖場（戶）及農(nóng)牧民的經(jīng)濟收入具有十分重要的意義。

本研究通過對病料進行剖檢、病原鑒定和實驗室診斷，最終確定該病情的病原為支原體，為綿羊健康養(yǎng)殖生產(chǎn)和對支原體感染的診斷和治療提供一定的參考。

1 材料和方法

2017年8月20日，于新疆某羊場開展試驗，對疑似傳染性胸膜肺炎的綿羊進行病情和癥狀跟蹤記錄，并對死亡羊只進行剖檢、病原鑒定和實驗室診斷。

1.1 病原鑒定

在無菌條件下，取病羊肺和肝組織涂片分別接種于普通LB培養(yǎng)平板和BHI培養(yǎng)平板，置37 ℃培養(yǎng)12～24 h。

1.2 實驗室診斷—PCR鑒定

參照已報道的綿羊傳染性胸膜肺炎基因的保守序列及文獻[9]，用生物軟件DNAstar設(shè)計了鑒定引物，擴增片段長度為400 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增體系為50 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，超純水補至50 μL，離心混合均勻后置PCR擴增儀中。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃循環(huán)變性30 s，56 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，進行30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，最后4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，參照標(biāo)準(zhǔn)DNA 2000 Marker，對待檢樣品目的DNA片段進行鑒定。用瓊脂凝膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物回收后，送上海生工生物工程有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況及臨床癥狀

2017年8月20日，羊場共計7只斷奶羔羊出現(xiàn)咳嗽、有漿液性鼻液，口腔內(nèi)有泡沫狀稀薄黏液，不愛運動，喜臥，驅(qū)趕后常出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、頭頸伸直、腰背弓起、眼瞼浮腫等癥狀，急性病例的病羊來不及治療，于當(dāng)日發(fā)病并死亡；慢性病例的病羊精神沉郁、消瘦、食欲減退或廢絕。病初體溫41 ℃左右，2～3 d后咳嗽加重，鼻液變?yōu)轲ひ盒?、漿液性，并呈鐵銹紅色或紅棕色，黏附在鼻孔周圍和上唇，形成污垢塊。按壓胸部時病羊表現(xiàn)敏感、疼痛，聽診肺部出現(xiàn)支氣管呼吸音和喘嗚聲，有的發(fā)生嚴(yán)重腹瀉。

2.2 剖檢結(jié)果

對死亡的羊只進行剖檢，可見大量淡黃色胸腔積液，并有腐臭味。病變主要表現(xiàn)在胸腔：肺腫大，色澤不均，部分發(fā)生肝變，肝變區(qū)與正常肺組織界限明顯，病程較長者部分肺葉萎縮壞死，切面呈大理石樣變，小葉間質(zhì)增寬，小葉之間界限明顯；胸膜厚而粗，上有黃色纖維素樣物附著，胸膜與心外膜、肺漿膜、橫隔胸膜相互粘連；縱隔淋巴結(jié)腫大，切面多汁并有出血點；心包有大量淡黃色液體，暴露空氣后形成纖維蛋白凝塊。個別有明顯的腸炎癥狀，腸黏膜潮紅且腸系膜淋巴結(jié)明顯腫大。肺臟呈白色，發(fā)生實變（圖1），有肺氣腫，氣管中有大量的白色泡沫（圖2）。

2.3 病原鑒定

在無菌條件下，取病羊肺和肝組織分別涂片接種于普通LB培養(yǎng)平板和BHI培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平板中未長菌落。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

待檢泳道擴增出大小約400 bp的目的條帶，結(jié)果為陽性；對PCR擴增產(chǎn)物進行了測序，并對測序結(jié)果進行BLAST分析，結(jié)果顯示，該菌16S RNA基因序列與支原體16S rRNA 基因序列的同源性為99%，則該病原確診為綿羊支原體。

3 結(jié)論與討論

綿羊支原體屬于內(nèi)源性致病菌，寄居于健康羊體上呼吸道，也普遍存在于養(yǎng)殖環(huán)境中，在羊只受到應(yīng)激刺激（如斷奶、寒冷、疫苗免疫、擁擠、運輸?shù)龋┗驙I養(yǎng)不良等情況下，綿羊支原體大量繁殖、毒力增強，引起羊群發(fā)病。近年來，有關(guān)綿羊支原體肺炎的研究多集中在絲狀支原體簇，特別是絲狀支原體山羊亞種[10]，我國則主要集中在人類呼吸道病原方面，而在綿羊肺炎病原研究方面的報道較少。目前，隨著養(yǎng)羊業(yè)規(guī)模化程度提高，呼吸道疾病的發(fā)病率及危害也日益嚴(yán)重。本試驗根據(jù)培養(yǎng)特性、理化特征和16S RNA保守區(qū)的序列分析，對新疆某羊場綿羊疑似傳染性胸膜肺炎的羊只進行判定和診斷，判定此次病原為綿羊肺炎支原體。該方法較傳統(tǒng)的細(xì)菌涂片染色后形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、動物試驗等更加快速、準(zhǔn)確，為綿羊健康養(yǎng)殖生產(chǎn)和對綿羊肺炎支原體感染的診斷和治療提供參考。

結(jié)合跟蹤試驗過程和該病的特征，建議臨床上選用高敏藥物或中敏藥物進行治療，避免濫用抗生素而引起的病原菌對大量藥物產(chǎn)生耐藥性，并按照“以管理為主、治療為輔、防治結(jié)合”的原則提出如下防治措施：（1）如發(fā)現(xiàn)病羊，必須馬上隔離且認(rèn)真消毒一切用具及場地，同時加強對羊群的觀察和藥物預(yù)防；（2）癥狀較輕的慢性感染羊或耐過后的羊只會在很長一段時間內(nèi)向外界排毒，感染健康羊群，所以病羊康復(fù)或癥狀明顯緩解后不可立即轉(zhuǎn)回健康羊群，有條件的情況下，需終生飼養(yǎng)在治療圈內(nèi)；（3）加強妊娠母羊的飼養(yǎng)管理，羔羊出生后要及時吃到初乳，從母乳中獲得多種母源抗體以增強抗病力，使羔羊出生時就有一副“好身板”；（4）引進外地羊只時，要先隔離、觀察30 d，因為很多羊病潛伏期比較長，沒有臨床癥狀不代表沒有感染，有可能已經(jīng)感染只是不在發(fā)病期；（5）由于規(guī)?；B(yǎng)羊場普遍存在廣泛使用抗生素的情況，使病原菌存在普遍的耐藥性，當(dāng)需要用藥治療或預(yù)防流行病時，要先對病原進行實驗室確診，再進行高效藥物的篩選（藥敏試驗），否則可能使疫情蔓延，造成不必要的、更大的經(jīng)濟損失。

參考文獻：

[1]鮑興智， 嚴(yán)軍. 綿羊肺炎支原體的研究進展[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志， 2009， 39（6）： 45-46.

[2]MACKAY J.NISBET D，F(xiàn)OGGIE A. Isolation of pleuropneumonia-like or ganisms （Genus Mycoplasma） from cases of sheep pulmonary adenomatosis （S.P.A）[J]. Vet rec， 1963， 75 （21）：550- 551.

[3]MARTRENCHAR A，BOUCHEL D，ZOYEM N.Isolation and experimental studies of Mycoplasma mycoides subsp.mycoides LC and Mycoplasma ovip neumoniae in goats in northern Cameroon [J].Small- rumin- res，1996，16（2）：179-184.

[4]GEORGE T D，SULLIVAN N D，LOVE J A，et al.Experimental transmission of pneumonia in sheep with a mycoplasm isolated from pneumonic sheep lung [J].Australian veterinary journal， 1971， 47： 282-283.

[5]儲岳峰， 趙萍， 高鵬程， 等. 綿羊和山羊霉形體病研究概述[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息， 2008（6）： 8-10.

[6]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所. 動物傳染病學(xué)[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，2008： 14-18.

[7]黨斌， 潘玉坤， 吳禹熹.山羊主要支原體感染的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2016（1）： 155-158.

[8]白永平.綿羊肺炎支原體的分離鑒定與敏感藥物試驗的研究[D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

[9]MCAULIFFE L， HATEHELL F M， AYLING R D， et al.Detection of Mycoplasma ov/pneumon/ae in Pasteure Ua-vaccinated sheep flocks with respiratory disease in England [J].Vet rec，2003，153：687-688.

[10]楊發(fā)龍， 王華， 岳華， 等.山羊中綿羊肺炎支原體的分離及鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010， 37（8）： 177-180.