劉玉芹

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建福州350018）

長期以來水稻育種家側(cè)重高產(chǎn)育種以解決人民溫飽問題，而忽視了優(yōu)質(zhì)育種。隨著社會的發(fā)展以及人民生活水平的日益提高，消費者對于稻米品質(zhì)的要求越來越高，帶有香味的優(yōu)質(zhì)大米愈來愈受消費者的青睞，尤其是米粒細(xì)長的香米型稻米。因此，培育高產(chǎn)質(zhì)優(yōu)的高檔香米愈來愈受到水稻育種者的重視，而不育系是影響雜交稻稻米品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一［2-3］。

SE21S是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選育的光溫互補(bǔ)秈型兩系核不育系，具有不育起點低（23.5℃），不育期長、穩(wěn)定、配組自由度高、制種安全、熟期轉(zhuǎn)色好、直鏈淀粉含量低（14.9%）、 谷粒細(xì)長等優(yōu)點［4］。SE21S是從“九五”至今福建及南方稻區(qū)兩系雜交稻配組頻率較高的不育系［5-6］。以其為母本，配制的雜交稻品種通過審定的有14個，分別為兩優(yōu)2186、福兩優(yōu)366、兩優(yōu)2161、兩優(yōu)2111、兩優(yōu)688、兩優(yōu)航2號、兩優(yōu)2167、兩優(yōu)多系1號、兩優(yōu)1019、兩優(yōu)2163、兩優(yōu)1259、兩優(yōu)科豐6號、兩優(yōu)15、兩優(yōu)1586。其中兩優(yōu)2186推廣面積最大，自審定以來累計推廣面積超過33.33萬hm2（數(shù)據(jù)來源國家水稻數(shù)據(jù)中心，中國水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫，http：//www.ricedata.cn/variety/index.htm），另外，福兩優(yōu)366、兩優(yōu)2161、兩優(yōu)688、兩優(yōu)1259和兩優(yōu)2111目前還在福建、云南等省大面積推廣。

改良SE21S的稻米香味品質(zhì)，不僅為打造集高產(chǎn)、米質(zhì)優(yōu)、抗性強(qiáng)、低直鏈淀粉含量等4大優(yōu)勢于一體的理想型SE21S拓寬不育系遺傳背景，還對提高SE21S配組組合的商品經(jīng)濟(jì)效益，增加農(nóng)民的收入具有十分深遠(yuǎn)的意義。香味的傳統(tǒng)鑒定方法有咀嚼法、KOH浸泡法等，受主觀因素，作物生長環(huán)境影響大，費時費力，嚴(yán)重制約育種進(jìn)程，而利用香味基因特異性的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇，可有效縮短育種進(jìn)程，它只需取少量的DNA即可，不受生育期和生育季節(jié)以及其他外部環(huán)境條件的影響，分析快速便捷［1］。

研究以香型軟米福香25B為香味供體親本，SE21S為受體親本，采用回交育種和分子標(biāo)記輔助選育方法與田間農(nóng)藝性狀調(diào)查相結(jié)合，將香味基因?qū)隨E21S中。香味基因分子標(biāo)記用GRFM04，它是依據(jù)水稻隱性香型品種與非香型品種的香味基因序列之間存在8bp堿基缺失，設(shè)計的Indel功能標(biāo)記,該標(biāo)記可區(qū)分香型純合，非香型純合和雜合3種基因型,且檢測的帶型與田間對應(yīng)的香味性狀完全對應(yīng)［1］。在回交各代利用GRFM04進(jìn)行香味基因的前景選擇，并結(jié)合農(nóng)藝性狀選育合適的株系留種，另外在高代BC6F1代利用檢測水稻品種真實性標(biāo)準(zhǔn)的48個SSR標(biāo)記加選遺傳背景，以減少后期田間自交分離的工作量。最后篩選到了5份遺傳背景與輪回親本基本相同但具有香味基因的SE21S改良株系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以IR58025B的改良系福香25B為供體親本，以福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所育成的兩系光溫敏核不育系SE21S為輪回受體親本，回交6代。用Indel標(biāo)記GRFM04［1］對各回交F1代進(jìn)行分子檢測跟蹤香味基因,背景回復(fù)分析用檢測水稻品種的真實性標(biāo)準(zhǔn)的48個SSR標(biāo)記。

1.2 水稻基因組DNA提取

在回交各代中取葉片，編號提取水稻基因組DNA。DNA提取用適于PCR的高通量DNA提取方法［7］。

1.3 PCR擴(kuò)增

引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SSR擴(kuò)增反應(yīng)采用10μLPCR反應(yīng)體系（表1）在ABI公司Veriti PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸45 sec，循環(huán)35次，72℃補(bǔ)充延伸7 min，最后4℃保存。

表1 10μl PCR反應(yīng)體系

1.4 電泳及成像

PCR擴(kuò)增完之后，往產(chǎn)物中加2ul 6xloading buffer,以1xTAE作電泳緩沖液，通過8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，電壓100 v,1.5 h。電泳完取下凝膠，用致善生物公司的Genefinder核酸染料對其染色20 min，最后用Gel Explorer凝膠成像儀成像保存。

1.5 香味鑒定

葉片香味鑒定參照KOH浸泡法［8］。將大約2 g新鮮葉片剪碎，放入培養(yǎng)皿中，加入10 mL 1.7%KOH溶液，蓋好蓋子，室溫浸泡15 min，然后打開蓋子，3人輪流聞其是否有香味。

米粒香味鑒定參照咀嚼法［9］。從每株供試植株隨機(jī)選取一穗中的20粒種子曬干后進(jìn)行咀嚼檢測香味。如果20粒全不香則認(rèn)為該植株無香味，為非香類；如果20粒全香則歸為有香類；如果20粒種子有香與不香則歸為雜合分離類。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用分子標(biāo)記輔助篩選含香味基因型的SE21S的回交群體

在雙親雜交回交的各代過程中，利用水稻香味基因特異性標(biāo)記GRFM04對輪回親本SE21S、香味基因供體親本福香25B以及各回交群體F1代基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選含有香味基因型的回交個體。在所分析的圖譜中有3種帶型，輪回親本SE21S不含香味基因帶型記為1；供體親本福香25B含有香味基因帶型記為2；含雙親雜合帶型的香味基因型記為3，不含香味基因型的回交株系其帶型表現(xiàn)為和輪回親本一樣的帶型，記為1。例如，在BC6F1群體GS89和GS92兩個群體中，分別有10株有香 味雜合基因型（見圖1a，1b中標(biāo)*的株系）。

圖1 GS89、GS92群體香味基因的分子檢測

2.2 香味傳統(tǒng)鑒定法驗證分子檢測篩選的植株

用KOH浸泡葉片法和咀嚼法香味鑒定分子檢測篩選的植株，發(fā)現(xiàn)雜合基因型的植株葉片無香味，只有部分米粒香，而自交1代后純合基因型的葉片才表現(xiàn)出香味。咀嚼法鑒定回交F1代的雜合基因型植株與香味標(biāo)記GRFM04分子檢測的結(jié)果一致。結(jié)果表明KOH浸泡葉片法不能鑒定出雜合基因型的植株，只能鑒定出純合香味基因型的植株，如果用此法各回交F1代再自交1代才能選到目的植株，這樣不僅延長了育種時間，還對鼻孔通道有損害，受人為主觀因素影響大，選擇準(zhǔn)確率低，易造成香味基因的丟失；而咀嚼法雖然可以鑒定出各回交F1代的雜合基因型植株，但是也要等結(jié)實收種后才能鑒定，而且易味覺疲勞，嚴(yán)重制約育種進(jìn)程。綜合考量還是用基于香味基因序列開發(fā)的功能標(biāo)記進(jìn)行分子檢測篩選目的植株更為便捷，它與香味基因共分離，不會因重組而打破，可以在各回交F1代幼牙或苗期準(zhǔn)確地篩選到雜合香味基因型的植株，大大縮短選育進(jìn)程。

2.3 背景回復(fù)分析含香味基因型的株系

在混合池背景回復(fù)分析中用農(nóng)業(yè)部2014年修訂的用于水稻品種真實性的DNA指紋圖譜分析中的48個SSR標(biāo)記對2個群體混合池進(jìn)行檢測，并對其背景回復(fù)進(jìn)行分析。將上述GS89與GS92含有香味基因型的單株（標(biāo)*的）基因組DNA構(gòu)建混合池，分別命名GS89混，GS92混。然后用鑒定水稻真實性標(biāo)準(zhǔn)的48對引物擴(kuò)增SE21S、福香25B、GS89混、GS92混。結(jié)果顯示GS89混和GS92混有46個位點與輪回親本SE21S相同（部分位點見圖2a），在2個位點RM71和RM85處這2個混合池含雙親的雜合帶型，說明背景有未回復(fù)的單株。其中，GS89混和GS92混在RM71位點均為雙親雜合帶，說明該位點2個群體均有未回復(fù)的單株；GS92混在RM85位點為雙親雜合帶，說明組成該混合池的單株有未回復(fù)的（圖2b）。

圖2 GS89混和GS92混的背景回復(fù)分析

用RM71檢測構(gòu)建GS89混單株DNA，用RM71、RM85檢測構(gòu)建GS92混的單株DNA，進(jìn)而確定這兩區(qū)的單株回復(fù)情況。結(jié)果顯示，GS89群體中攜帶香味基因的10個單株中有單株2-5、2-7、2-8、4-3共4株遺傳背景完全回復(fù)（圖3a）；GS92群體中3-6共1株遺傳背景完全回復(fù)（圖3b）。

圖3 背景未回復(fù)的標(biāo)記檢測GS89混和GS92混的各單株

結(jié)果篩選到 GS89 2-5、GS89 2-7、GS89 2-8、GS89 4-3、GS92 3-6這些單株中不僅含有供體親本福香25B的香味基因，而且這些株系背景回復(fù)均達(dá)到了100%，理論上這些株系與輪回親本SE21S的遺傳背景完全一樣且含有香味基因，可以通過自交分離獲得純合的香味SE21S,直接用于配制組合，在生產(chǎn)上大面積使用,進(jìn)一步提高SE21S配制組合的稻米品質(zhì)。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，香味育種越來越多的應(yīng)用分子標(biāo)記輔助技術(shù)。朱映東等利用酶切分子標(biāo)記輔助選育，將香型正常胚水稻里的香味基因?qū)氲椒窍憔夼咚局谐晒Φ剡x育出香型巨胚水稻“上師大8號”［10］；杜雪樹等利用香味Aro標(biāo)記輔助選育，將香稻品種美香占的香味基因?qū)氲交謴?fù)系986和R476中，最終選育出抗白葉枯病基因Xa21和抗褐飛虱Bph14的香型恢復(fù)系C349和C354［11］。趙志鵬等通過香味分子標(biāo)記輔助選育，將粳稻“武香075”的香味基因?qū)雰?yōu)質(zhì)水稻“金豐”中，成功選育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)香型粳稻“香粳1305”［12］。本研究意在將IR58025B的改良系福香25B的香味基因通過回交選育結(jié)合分子標(biāo)記和田間農(nóng)藝性狀輔助選育導(dǎo)入SE21S中，并在BC6F1代中增加背景回復(fù)篩選。由于在各回交1代幼芽階段就可用分子標(biāo)記篩選目的植株，進(jìn)行下一輪的回交，省去了大量田間管理工作，所以利用分子標(biāo)記輔助選育既快速地跟蹤選擇了香味基因，又保證了在雜交過程中背景的純度，加快了育種進(jìn)程。