黃立新， 劉 熹

（1.鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村工作委員會(huì)，河南鄭州 450000；2.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南鄭州450008）

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus Punctatus） 屬于鯰形目鮰科，原產(chǎn)于美國，體形較長，體表光滑無鱗，背部呈淺灰色，腹部呈乳白色，身體兩側(cè)有不規(guī)則淺黑色小點(diǎn)，尾鰭分叉較深。頭部有觸須4對(duì)，有脂鰭，屬于廣溫性魚類。我國的斑點(diǎn)叉尾鮰是在1984年從美國引進(jìn)的，經(jīng)過后期的馴養(yǎng)和推廣，已在我國多個(gè)省、市、區(qū)廣泛養(yǎng)殖。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高密度、集約化養(yǎng)殖，養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，魚類細(xì)菌性疾病逐年增多，使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，引起斑點(diǎn)叉尾鮰感染細(xì)菌性疾病主要有套腸癥[1]、腸道敗血癥[2]、暴發(fā)性敗血癥[3]、腹水病[4]等，斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥是較為嚴(yán)重的細(xì)菌性疾病，具有發(fā)病快、死亡率高的特點(diǎn)。近3年，我們對(duì)河南省內(nèi)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖區(qū)域進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰腸道疾病尤其是套腸癥發(fā)病嚴(yán)重。

本研究以發(fā)病典型的患病魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其病原菌進(jìn)行分離鑒定，并研究致病菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性，為斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的研究及防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

病樣為河南省鄭州滎陽養(yǎng)殖池塘的患病斑點(diǎn)叉尾鮰。健康斑點(diǎn)叉尾鮰，規(guī)格為：體長（16.5±10）cm，體重（39±5） g，取自湖北良種繁育基地，試驗(yàn)前在消毒水簇箱內(nèi)暫養(yǎng)一周，確認(rèn)無病后用作后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 試劑

藥敏紙片購自杭州天和微生物技術(shù)有限公司，LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和MH（Mueller-Hinton）培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，瓊脂粉購自北京索萊寶科技有限公司，API-20E為法國梅里埃公司生產(chǎn)。2×ES Taq Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。細(xì)菌DNA提取試劑盒均購自北京天根生物公司。

1.3 病原菌的分離培養(yǎng)

取發(fā)病典型癥狀的斑點(diǎn)叉尾鮰，在無菌條件下，從病魚肝、腎、脾和腹水等取樣，劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌進(jìn)行純化養(yǎng)，將純化的菌株再轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，加25%的甘油-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 攻毒試驗(yàn)

挑純化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)18～20 h，離心棄上清，用無菌生理鹽水洗滌菌體，采用比濁法和細(xì)菌計(jì)數(shù)方法將菌懸液稀釋至1.0×108cfu/mL，依次十倍梯度稀釋至1.0×107cfu/mL、1.0×106cfu/mL、1.0×105cfu/mL、1.0×104cfu/mL。取暫養(yǎng)一周后的健康斑點(diǎn)叉尾鮰腹腔注射菌懸液，每組注射10尾，注射量為每尾0.2 mL，空白對(duì)照組注射0.2 mL的無菌生理鹽水。在24～30℃水溫下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察15 d，記錄魚的死亡數(shù)量及發(fā)病癥狀。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 API-20E生化鑒定

采用API-20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，按照鑒定系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的產(chǎn)品說明書對(duì)病原菌進(jìn)行生化鑒定。同時(shí)進(jìn)行接觸酶、氧化酶、V-P和葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)。

1.5.2 16S rRNA基因分子鑒定

將菌株接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，以28℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)12 h，12000 rpm離心3 min棄上清獲取菌體。按照DNA試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，-20℃保存。采用16S rRNA基因[5]進(jìn)行PCR 擴(kuò) 增 ： F∶5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，R∶5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'，反應(yīng)體系(20μL)：2×ES Taq Master Mix 10μL，上下游引物各 0.8μL，DNA模板 1μL，用雙蒸水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

1.6 藥敏試驗(yàn)

蘸取純化的細(xì)菌培養(yǎng)物于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，將生長至對(duì)數(shù)生長期的菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛?，?00ul均勻涂布于MH平板上，等距離貼上藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑的大小，根據(jù)藥敏紙片說明書判定耐藥（R）、敏感（S）或中度敏感（I）。

2 結(jié)果

2.1 患病魚臨床癥狀

患病斑點(diǎn)叉尾鮰游動(dòng)緩慢、食欲減退，體表充血、出血并出現(xiàn)大小不等的脫色斑；肛門外突、發(fā)紅，后腸段的一部分脫出到肛門外，腹部膨大；腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，腸道中后段出現(xiàn)腸套疊，肝臟腫大，顏色變淡發(fā)白或呈土黃色?；剪~的肝臟出現(xiàn)出血斑，質(zhì)地變脆，脾、腎出現(xiàn)腫大現(xiàn)象。

2.2 細(xì)菌形態(tài)

從患典型套腸癥的斑點(diǎn)叉尾鮰肝臟中分離到一株優(yōu)勢菌，暫命名為ZX-1。菌株ZX-1在LB瓊脂培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)圓形、表面濕潤、中央微凸、邊緣光滑整齊的單菌落，革蘭氏染色陰性、短桿狀，直徑在 1～2.5mm。

2.3 攻毒試驗(yàn)結(jié)果

采取腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果表明，ZX-1對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰有強(qiáng)致病力，采用改良的寇氏法計(jì)算菌株的半致死劑量 LD50為3.91×105cfu/mL。發(fā)病魚病癥與自然發(fā)病魚癥狀一致，主要表現(xiàn)為體表充血、出血，肛門紅腫、外突，腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，腸道中后段出現(xiàn)腸套疊，肝臟腫大，顏色變淡發(fā)白。另外從攻毒感染發(fā)病的魚體中重新分離到的菌株經(jīng)生化鑒定和分子鑒定表明其與感染用的ZX-1一致，由此可證明該菌株為此次斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的病原菌。

表1 ZX-1 菌株對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰攻毒感染試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of Ictalurus Punctatus infected with strain ZX-1

2.4 菌種鑒定

2.4.1 API-20E生化鑒定

ZX-1菌株的氧化酶陽性，可發(fā)酵葡萄糖，不產(chǎn)生H2S，硝酸鉀、吲哚、色氨酸、檸檬酸、精氨酸、N-乙酰-葡萄糖胺、甘露糖和V-P試驗(yàn)等陽性，鳥氨酸脫羧酶、脲酶、色氨酸脫羧酶、已二酸、肌醇、山梨醇、密二糖、阿拉伯糖、苦杏仁甙試驗(yàn)均為陰性。API-20E系統(tǒng)鑒定結(jié)果見表2。

2.4.2 16S rRNA基因鑒定

PCR擴(kuò)增ZX-1菌株的16S rRNA基因片段約1500 bp，測序結(jié)果表明該片段有 1487 bp，在GenBank中的登陸序列號(hào)為AB473013。同源性檢索結(jié)果表明ZX-1菌株與氣單胞菌屬的溫和氣單胞菌核苷酸同源性達(dá)99%以上。從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中選取同源性較高的同源性序列，利用MEGA6.0軟件建立進(jìn)化樹（圖1）。ZX-1與溫和氣單胞菌菌株AB473013聚成一個(gè)分支。

表2 ZX-1菌株的API-20E鑒定結(jié)果Tab.2 The identification of strain ZX-1byAPI-20E

圖1 ZX-1菌株16S rRNA基因序列進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain ZX-1 based on 16S rRNA sequence

2.5 藥敏試驗(yàn)

ZX-1菌株對(duì)16種抗菌藥物敏感性研究表明，該菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物如氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感，另外對(duì)氯霉素、氟苯尼考和復(fù)方新諾明敏感；對(duì)青霉素、阿莫西林、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、利福平、四環(huán)素耐藥。

表3 ZX-1菌株對(duì)16種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)Tab.3 Antibiotic sensitivity test of 16 antimicrobial drugs against ZX-1

3 討論

斑點(diǎn)叉尾鮰是中國主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，因此肉質(zhì)上乘、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)受到廣大養(yǎng)殖戶的青睞。目前，斑點(diǎn)叉尾鮰的細(xì)菌性病原菌已報(bào)道的有氣單胞菌（Aeromonas）、假單胞菌（Pseudomonas）和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）等[6]，溫和氣單胞菌可引起多種魚類患腸道疾病[4]，快速又準(zhǔn)確地鑒定出魚類的這些致病菌，并采取及時(shí)有效的防控和治療措施，對(duì)減少水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失具有重大意義。

本研究采用快速診斷細(xì)菌性疾病的API-20E生化系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示菌株ZX-1可發(fā)酵葡萄糖，不產(chǎn)生H2S，利用硝酸鉀、色氨酸、精氨酸、甘露糖等，不利用阿拉伯糖、肌醇、山梨醇等的理化反應(yīng)與彭亞等[4]的結(jié)果一致。但其鼠李糖陽性、山梨醇陰性、阿拉伯糖陰性反應(yīng)與樊海平等[7]的研究結(jié)果不一致。說明相同菌株、理化性質(zhì)不同，可能與其宿主和其分布的地域等有關(guān)。16S rRNA基因作為細(xì)菌分類鑒定的分子學(xué)方法具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，故其序列比對(duì)已成為首選的分子學(xué)技術(shù)。本研究中ZX-1的16S rRNA序列與GenBank中的溫和氣單胞菌AB473013的同源性達(dá)99%，并且該菌株與溫和氣單胞菌AB473013在進(jìn)化樹上聚為一支。根據(jù)王海娟等[5]的研究，當(dāng)細(xì)菌的16S rRNA基因同源性在99%以上時(shí)，可被認(rèn)為屬于同一種。本研究同時(shí)采用傳統(tǒng)微生物鑒定和分子鑒定兩種方法，從而準(zhǔn)確地從發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰中分離鑒定出了溫和氣單胞菌。

攻毒試驗(yàn)表明，從瀕死斑點(diǎn)叉尾鮰中分離到的菌株ZX-1可感染健康斑點(diǎn)叉尾鮰，并對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰有較強(qiáng)的致病和致死作用，且發(fā)病癥狀一致，均表現(xiàn)出體表充血、出血，肛門紅腫、外突，腹腔內(nèi)有淡黃色腹水，腸道中后段出現(xiàn)腸套疊，肝臟腫大、顏色變淡發(fā)白等癥狀。從攻毒患病斑點(diǎn)叉尾鮰中分離的細(xì)菌經(jīng)鑒定與ZX-1菌株的生理生化鑒定和分子鑒定結(jié)果一致，證明ZX-1為斑點(diǎn)叉尾鮰患套腸癥的致病菌。

水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過程中常選用抗菌藥物對(duì)細(xì)菌感染進(jìn)行防治，但是過多使用抗菌藥物將導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性。經(jīng)16種抗菌類藥物對(duì)分離菌的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示該菌對(duì)喹諾酮類敏感，對(duì)氯霉素、氟苯尼考和復(fù)方新諾明也敏感；對(duì)氨基糖苷類、青霉素類、利福平和四環(huán)素耐藥。曹海鵬等[8]研究表明，金魚（Carassius auratus） 源溫和氣單胞菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星等高度敏感，對(duì)新生霉素、氨芐青霉素等均不敏感，與本文研究結(jié)果存在差異。劉洋等[9]分離的細(xì)鱗魚（Brachymystax lenok） 源溫和氣單胞菌對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等高度敏感，對(duì)氯霉素、復(fù)方新諾明中度敏感，對(duì)紅霉素耐藥，與本文研究結(jié)果存在差異。所以相同菌種但不同來源的菌株的耐藥性因宿主或地理環(huán)境的不同而存在差異性。根據(jù)本研究結(jié)果，應(yīng)及時(shí)控制當(dāng)?shù)貙?duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物的使用。本研究可為進(jìn)一步研究溫和氣單胞菌的耐藥機(jī)制、監(jiān)測水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和魚體中細(xì)菌的耐藥性提供參考。