林花 王霞 車成來(lái) 王欣宇 王宇輝 金龍哲

（延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉133000）

靈芝Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.)Karst. 為多孔菌科真菌靈芝的干燥子實(shí)體，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載靈芝具有“益心氣”、“補(bǔ)肝益氣”、“安心神”的作用[1]，靈芝功能性食品是以靈芝多糖和破壁靈芝孢子粉為主要原料，按一定比例配制而成的產(chǎn)品。

現(xiàn)代研究表明，靈芝孢子粉和靈芝多糖能增強(qiáng)人體的免疫功能[2]，其中靈芝孢子對(duì)現(xiàn)代常見(jiàn)的疾病如心腦血管疾病、糖尿病或哮喘等均有一定的療效[3-5]，靈芝孢子亦有研究表明具有抗疲勞、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和抗衰老等作用[6]，而破壁后的靈芝孢子粉中的有效成分更易被人體內(nèi)攝取吸收。靈芝多糖[7]是靈芝中最有效的成分之一，研究具有降血糖[8-9]、降血脂[10-11]、抗腫瘤[12-14]等作用。本品兩者配伍，其具有更好的增強(qiáng)免疫力功效。本研究通過(guò)臟器指數(shù)測(cè)定，ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，血清溶血素測(cè)定，抗體生成細(xì)胞檢測(cè)，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞、小鼠碳廓清、NK細(xì)胞活性測(cè)定等試驗(yàn)，研究探討靈芝功能性食品對(duì)小鼠免疫力作用，以期了解靈芝功能性食品對(duì)小鼠是否具有免疫調(diào)節(jié)作用，旨在為靈芝系列產(chǎn)品的研制加工及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

靈芝功能性食品；選用體重18～22g的雄性Balb/c小鼠（SPF級(jí)）。

1.2 劑量選擇

將已購(gòu)回的動(dòng)物飼喂基礎(chǔ)飼料，逐步適應(yīng)后，隨機(jī)分組為0.33、0.67和1.00 g/kg·bw組（分別相當(dāng)于送檢方推薦的人體每日服用建議劑量的10倍、20倍和30倍）及對(duì)照組。稱取送檢樣品5g，加入少量滅菌去離子水，待充分碾磨后，加滅菌去離子水定容至100L，充分混勻，作為實(shí)驗(yàn)組高劑量組灌胃液；將滅菌水與高劑量組按照1/2的比例混勻后灌胃即為中劑量組灌胃液；用同樣的方法，滅菌水對(duì)倍稀釋中劑量組灌胃液，即為低劑量組灌胃液，該組為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組則以滅菌水灌胃。1次/d灌胃量為20mL/kg.bw，連續(xù)灌胃30d灌以相應(yīng)的劑量。

1.3 免疫指標(biāo)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 臟器/體重比值測(cè)定

連續(xù)灌胃30d，稱取體重，處死小鼠，取出脾臟、胸腺，分別稱量其各臟器的重量，并計(jì)算各臟器/體重比值（以mg/10g表示）。

1.3.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法)

在連續(xù)給藥的第25天時(shí)，對(duì)每只小鼠進(jìn)行腹腔注射 0.2mL的2%SRBC免疫，再灌胃4d，測(cè)致敏后4d，測(cè)左右足跖厚度3次，取平均值；在左右足跖部位皮下注射20%（v/v）SRBC，每只20μL。在注射24h后，測(cè)量該部位厚度3次，取平均值。計(jì)算攻擊期間足跖厚度的差值，差值代表小鼠足跖增厚的程度。比較受試藥物組的差值與對(duì)照組的差值，若顯著高于對(duì)照組，則確定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）

灌胃30d后處死小鼠，在無(wú)菌狀態(tài)下取出脾臟并撕碎，過(guò)200目篩網(wǎng)，用Hank’s液洗3次，用1640培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液3×106 個(gè)/mL。將每組脾細(xì)胞懸液放入每孔1mL的24孔板中，每組2孔，一孔作為對(duì)照組，加7550μL/孔ConA液（相當(dāng)于7.5μg/mL），置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)68h后吸取0.7mL上清液，加入吸取相同量的1640培養(yǎng)液（不含小牛血清）和50μL的5mg/mL MTT液，培養(yǎng)4h。取出培養(yǎng)板，加入1mL酸性異丙醇，使紫色結(jié)晶完全溶解。待溶解后，將其移入比色杯中，在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，淋巴細(xì)胞的增值能力為加ConA孔OD值的均值減去未加ConA孔OD值的均值，比較受試樣品組的光密度差值與對(duì)照組的光密度值，若顯著高于對(duì)照組，則確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性。

1.3.4 血清溶血素測(cè)定（血凝法）

于給藥25d后，每只動(dòng)物腹腔注射0.2mL 2%的SRBC 免疫，再灌胃5d，眼球取血，離心10min，將取得的上清液每份稀釋12孔，稀釋不同濃度的血清，每孔100μL，再加入100μL 0.5%的SRBC懸液，混勻，37℃條件下觀察濕盒的結(jié)果，3h后記錄每個(gè)孔的凝集程度。計(jì)算抗體積數(shù)。比較受試樣品組的抗體積數(shù)與對(duì)照組的抗體積數(shù)，若顯著高于對(duì)照組，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.5 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)

在連續(xù)給藥25d后，對(duì)動(dòng)物腹腔注射0.2mL 2%的SRBC進(jìn)行免疫，再灌胃5d，處死小鼠，取其脾臟，勻碎過(guò)篩，用Hank’s液潔凈3次，用完全1640培養(yǎng)液配至5×106 個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，備用。將50μL 10%SRBC及20μL已配好的脾細(xì)胞懸液加入0.5mL（45～50℃）表層培養(yǎng)基中，快速攪拌，置于掛膜玻片使其凝固，將玻片扣放在片架上，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5h放于玻片架凹槽內(nèi)，并加入用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體，培養(yǎng)1.5h后，以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示，計(jì)數(shù)溶血抗體生成細(xì)胞數(shù)，比較受試樣品組的空斑數(shù)與對(duì)照組的空斑數(shù)，若顯著高于對(duì)照組，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

給藥30d后，每只動(dòng)物進(jìn)行腹腔注射1mL 20%的雞紅細(xì)胞懸液，待30min后將其頸部處死，固定在鼠板上進(jìn)行解剖，向腹腔注射2mL生理鹽水，并在小鼠體內(nèi)混勻，從腹腔內(nèi)吸出1mL洗液，放置于37℃濕盒內(nèi)，待30min后取出，經(jīng)漂洗、晾干、固定，加入4%GiemsaPBS液染色3min，漂洗、晾干，鏡檢計(jì)數(shù)。計(jì)算吞噬百分率及吞噬指數(shù)。比較受試藥物組與對(duì)照組的吞噬百分率或吞噬指數(shù)，若相比有顯著性差異，可確定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.7 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

灌胃30d后，將0.01ml/g·bw 1：4稀釋的墨汁注入小鼠尾靜脈，立即計(jì)時(shí)，于注入2min、10min時(shí)，取血收集20μL動(dòng)物內(nèi)眥靜脈叢，放入含2mL 0.1%Na2CO3溶液的試管中，混勻，用7200分光光度計(jì)，測(cè)定OD值，其中0.1%Na2CO3溶液作為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。處死小鼠，取其體內(nèi)肝臟和脾臟，吸凈血污，稱重并計(jì)數(shù)吞噬指數(shù)a。比較受試藥物組的吞噬指數(shù)a與對(duì)照組的吞噬指數(shù)a，顯著高于對(duì)照組，若則判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.8 NK細(xì)胞活性測(cè)定

小鼠灌胃后，將其頸部處死取出脾臟，用Hank’s液洗液洗滌3次，用完全1640培養(yǎng)液分別配制細(xì)胞懸液2×107 個(gè)/mL。取300μL動(dòng)物的細(xì)胞懸液，放于96孔板中，每孔加100μL靶細(xì)胞4×105 個(gè)/mL（YAC-1細(xì)胞），分別取100μL的靶細(xì)胞和培養(yǎng)液，作為靶細(xì)胞自然釋放孔，同時(shí)取100μL的靶細(xì)胞和1%NP-40，作為最大釋放孔，各3孔，37℃置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，取出離心5min。向各孔取100μL上清液，加入100μL基質(zhì)液，置于另一培養(yǎng)板中，10min后加30μL 1mol/L HCl 直至反應(yīng)終止，在分光光度計(jì)492nm處，測(cè)定OD值，并計(jì)算NK細(xì)胞活性率。比較受試動(dòng)物組的NK細(xì)胞活性與對(duì)照組NK細(xì)胞活性，若其細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響

由表1可見(jiàn)，將不同劑量的靈芝功能性食品給予小鼠30d，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，小鼠臟器/體重比值在低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組間比較均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明靈芝功能性食品對(duì)小鼠臟器/體重比值無(wú)影響。

表1 樣品對(duì)動(dòng)物臟器/體重比值的影響

2.2 樣品對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響

抗原攻擊后24h，比較低劑量組與對(duì)照組，足跖腫脹度未出現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），中劑量組和高劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其足跖腫脹度有顯著性差異（P＜0.05），如表2可見(jiàn)，中、高劑量的靈芝功能性食品能提高動(dòng)物遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。

表2 樣品對(duì)動(dòng)物遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）的影響

2.3 樣品ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）

經(jīng)方差分析，靈芝功能性食品對(duì)小鼠進(jìn)行各劑量組給藥30d后，各劑量組與陰性對(duì)照組小鼠相比，顯示其光密度差值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明靈芝功能性食品對(duì)ConA誘導(dǎo)動(dòng)物淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力無(wú)影響。見(jiàn)表3。

表3 樣品對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

2.4 樣品對(duì)小鼠血清溶血素產(chǎn)生的影響

將不同劑量的樣品提取物給藥小鼠30d，在低、中、高劑量組與陰性對(duì)照組進(jìn)行組間比較，其抗體積數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 樣品對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響

2.5 樣品抗體生成細(xì)胞檢測(cè)

對(duì)小鼠進(jìn)行各劑量組給藥30d后，高劑量組與對(duì)照組相比時(shí)發(fā)現(xiàn)，其抗體生成細(xì)胞無(wú)明顯差異（P＞0.05），而低、中劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其空斑數(shù)顯著高于對(duì)照組的空斑數(shù)，其抗體生成細(xì)胞有顯著性差異（P＜0.05），如表5。

表5 樣品對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

2.6 樣品對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

將小鼠灌以不同劑量的靈芝功能性食品30d，如表6，各劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表6 樣品對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

2.7 樣品小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

如表7所示，在給藥小鼠30d期間，低劑量組和中劑量組與對(duì)照組小鼠相比，碳廓清吞噬指數(shù)a無(wú)明顯差異（P＞0.05），高劑量組與對(duì)照組小鼠相比，碳廓清吞噬指數(shù)a有顯著差異（P＜0.05）。

表7 樣品對(duì)小鼠碳廓清的影響

2.8 樣品對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

如表8，不同劑量組藥物對(duì)小鼠進(jìn)行給藥，其NK細(xì)胞活性中各組劑量組與對(duì)照組比較，NK細(xì)胞活性率無(wú)明顯差異（P＞0.05），藥物可增強(qiáng)小鼠的NK細(xì)胞活性。

表8 樣品對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

3 結(jié)論與討論

靈芝多糖可有效提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞增殖能力以及體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的功能[15]，實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于提高小鼠免疫功能的作用方面，破壁后的靈芝孢子粉要明顯高于破壁前[16]。靈芝功能性食品是由靈芝多糖粉、破壁靈芝孢子粉經(jīng)科學(xué)配置而成，兩者均具有增強(qiáng)機(jī)體特異性與非特異性細(xì)胞免疫功能，對(duì)體液免疫、細(xì)胞免疫、非特異性免疫功能均具有一定的作用。對(duì)Balb/c小鼠分別進(jìn)行灌胃給予靈芝功能性食品低、中、高3種不同劑量的樣品30d后，未見(jiàn)本品對(duì)小鼠體重和增重有不良影響。在小鼠臟器/體重比值測(cè)定中，各劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其臟器/體重比值無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其足跖腫脹度有明顯差異（P＜0.05），研究表明上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與給藥劑量有關(guān)。在小鼠抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，低、中劑量組與對(duì)照組小鼠相比，其抗體生成細(xì)胞有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明低劑量組和中劑量組呈陽(yáng)性結(jié)果，而高劑量組的靈芝功能性食品對(duì)小鼠無(wú)影響。在碳廓清實(shí)驗(yàn)中，高劑量組的碳廓清吞噬指數(shù)a明顯高于對(duì)照組，具有顯著性差異（P＜0.05），表明靈芝功能性食品具有提高非特異性免疫功能的作用。靈芝功能性食品有增強(qiáng)動(dòng)物腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力、有激活免疫細(xì)胞NK細(xì)胞活性的能力，實(shí)驗(yàn)證明靈芝功能性食品對(duì)細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用。根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表明靈芝功能性食品具有增強(qiáng)小鼠體內(nèi)免疫力功能的作用。