邢玉潔,張榮懷,呂 穎,劉仲偉,潘 碩,趙 娜

(陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)一科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:dr.zhaona@qq.com)

克山病(Keshan disease,KD)首次發(fā)現(xiàn)于1935年,地點(diǎn)位于黑龍江省克山縣,故被稱為克山病[1]。因?yàn)镵D只發(fā)生在中國(guó)的特定地區(qū),所以它也被歸類為中國(guó)的地方病。此后,在中國(guó)的東北和西南部的其他地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了KD,包括四川省和云南省[2]。KD具有較高的病死率,目前大多數(shù)研究者認(rèn)為KD與硒缺乏密切相關(guān)[3],這個(gè)理論是基于KD流行地區(qū)的土壤一般是缺硒,且生長(zhǎng)在該地區(qū)的谷粒也是硒缺乏。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在心血管疾病中發(fā)揮著十分重要的作用,其異常調(diào)控會(huì)導(dǎo)致各種心臟疾病的發(fā)生[4,5]。然而,目前尚無Wnt/β-catenin信號(hào)通路和克山病的相關(guān)研究。因此,本研究擬構(gòu)建硒缺乏大鼠模型,探索硒缺乏大鼠心臟功能的情況及Wnt/β-catenin信號(hào)通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，平均體質(zhì)量(75±10)g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK陜2014-003，被隨機(jī)分為硒缺乏組20只和對(duì)照組20只。

1.2 主要試劑及飼料

Wnt抗體(美國(guó)CST公司)、β-catenin抗體(美國(guó)CST公司)、β-Actin抗體(Santa Cruz公司)、BNP檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Biosite公司)。使用AIN-93M硒缺乏飼料(硒含量為0.01 mg/kg)及AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料(硒含量為0.5 mg/kg),兩者均購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司，具體配方見表1。

表1標(biāo)準(zhǔn)飼料和硒缺乏飼料的配方

Table1Formulaofstandardfeedandseleniumdeficiencyfeed

成分(g/kg飼料)AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料AIN-93M(硒缺乏)飼料蔗糖599.5599.5酵母300300AIN-93礦物質(zhì)混合物(無硒)3035AIN-93礦物質(zhì)混合物(含硒)50DL-甲硫氨酸33魚油4040玉米油1010膽堿2.52.5

1.3 構(gòu)建硒缺乏大鼠模型

AIN-93M硒缺乏飼料喂養(yǎng)硒缺乏組大鼠,AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)對(duì)照組大鼠,共喂養(yǎng)17周。

1.4 血清硒含量和BNP水平檢測(cè)

喂養(yǎng)大鼠17周以后,通過眼眶后靜脈采集血液樣本,然后用2,3-二氨基萘熒光法測(cè)定血硒的含量,采用BNP檢測(cè)試劑盒測(cè)定血漿BNP水平。

1.5 心臟超聲檢測(cè)大鼠心功能

硒缺乏大鼠模型建立成功后,10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,暴露心前區(qū)并固定大鼠,用動(dòng)物心臟超聲探頭對(duì)大鼠行心臟超聲檢查,測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。

1.6 Western blot檢測(cè)Wnt及β-catenin表達(dá)水平

收集大鼠的心肌組織后在冰上用研缽研碎,加入RIPA裂解液裂解30 min,混勻后12 000 r/min離心5 min,取上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。于配好的SDS-PAGE凝膠中每孔加入20 μl樣本,120 V恒定電壓電泳120 min,將電泳后的凝膠按照Wnt及β-catenin的分子Marker進(jìn)行切取,在轉(zhuǎn)膜緩沖液中放置5 min。再自下而上按照濾紙-硝酸纖維膜-凝膠-濾紙的順序進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為50-60 min。轉(zhuǎn)膜后浸入脫脂牛奶中進(jìn)行封閉90 min,加入Wnt及β-catenin抗體(濃度均為1 ∶1 000)4 ℃孵育12 h,再加入濃度1 ∶2 000的二抗室溫孵育1 h,加入發(fā)光液在暗室內(nèi)發(fā)光,曝光顯像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清硒檢測(cè)結(jié)果

硒缺乏組大鼠的血清硒水平顯著低于對(duì)照組大鼠的血清硒水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.035±0.002)ng/Lvs(0.142±0.004)ng/L,P<0.05]。

2.2 大鼠血漿BNP檢測(cè)結(jié)果

大鼠血漿BNP水平在硒缺乏組顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1 450±4.64)pg/mlvs(850±3.27)pg/ml,P<0.05]。

2.3 大鼠心臟超聲檢測(cè)結(jié)果

心臟超聲結(jié)果示:與對(duì)照組比較,硒缺乏組LVEF及LVFS顯著降低,而LVEDD及LVESD顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

2.4 大鼠心肌組織Wnt/β-catenin表達(dá)水平

Western blot結(jié)果示:硒缺乏大鼠心肌組織中Wnt水平及β-catenin水平與對(duì)照組Wnt水平及β-catenin水平相比顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(25.06±1.37)%vs(12.13±1.68)%;(30.15±1.46)%vs(10.09±1.52)%,P<0.05,見圖3]。

表2心臟超聲參數(shù)比較兩組大鼠的心功能

Table2Comparisonofcardiacfunctionbyechocardiographicparametersbetweentwogroups

分組nLVEF(%)LVFS(%)LVEDD(mm)LVESD(mm) 對(duì)照組 2072.54±12.2870.58±7.433.95±0.421.25±0.27 硒缺乏組2042.73±11.03*48.74±5.49*5.87±0.39*2.93±0.36*

與對(duì)照組比較,*P<0.05

圖3 兩組Wnt及β-catenin表達(dá)水平比較Figure 3 The expression levels of Wnt and β-catenin in two groups

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查和人群干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,一致認(rèn)為硒缺乏是KD的重要致病因素[6]。早期的一項(xiàng)基于人群的臨床研究表明,硒缺乏水平與心血管結(jié)局密切相關(guān)[7]。在最近的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究中,冠狀動(dòng)脈疾病患者的血清硒濃度與急性冠脈綜合征的死亡率成反比。除了經(jīng)典的危險(xiǎn)因素,比如急性冠狀動(dòng)脈綜合征的壞死標(biāo)志物和左室射血分?jǐn)?shù),硒缺乏被認(rèn)為是獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[8]。在動(dòng)物研究中,硒缺乏與心功能參數(shù)的惡化和心肌肥厚也有著明顯的相關(guān)性[9]。本研究用硒缺乏飼料喂養(yǎng)大鼠,通過血硒測(cè)定顯示:硒缺乏組大鼠的血清硒水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05),由此驗(yàn)證了硒缺乏大鼠模型的成功建立。

模型建立成功后,本研究采用血漿BNP水平和心臟超聲測(cè)定硒缺乏大鼠的心功能的變化,結(jié)果表明,硒缺乏組大鼠BNP水平、LVEDD和LVESD明顯升高,而LVEF和LVFS明顯降低。目前,已將BNP作為判斷心力衰竭的臨床指標(biāo)之一,具有較高的敏感性和特異性,因此本實(shí)驗(yàn)選擇BNP作為心力衰竭的判定指標(biāo)[10-12]。此外,LVEF也是臨床上常用的心功能評(píng)價(jià)指標(biāo),所以本研究采用這兩個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)心功能,結(jié)果均表明硒缺乏可以導(dǎo)致大鼠心功能的下降,進(jìn)而引起心力衰竭的發(fā)生。

硒缺乏導(dǎo)致心力衰竭的機(jī)制目前尚不十分清楚。Wnt信號(hào)通路在心臟和血管的發(fā)生發(fā)展中必不可少,它參與心臟的形態(tài)生成、心臟瓣膜的形成、內(nèi)皮細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞的增殖等過程[13]。因此,Wnt信號(hào)的缺陷會(huì)導(dǎo)致各種心臟和血管畸形的發(fā)生。正常情況下,在成人心臟和血管中Wnt信號(hào)很少被激活,但是在一些由于壓力負(fù)荷導(dǎo)致的病理性心臟重塑過程中,甚至在血管損傷繼發(fā)心肌梗死發(fā)生時(shí),該信號(hào)通路可以被激活。當(dāng)Wnt信號(hào)被激活后,細(xì)胞漿內(nèi)的β-catenin就會(huì)發(fā)生降解并逐漸聚集,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核激活靶基因,發(fā)揮對(duì)應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[14]。Zelarayn等[15]研究發(fā)現(xiàn)敲除β-catenin有利于心肌梗死后左心室的重構(gòu),部分是通過促進(jìn)心臟固有祖細(xì)胞的分化導(dǎo)致的。也就是說,β-catenin的下調(diào)可以提高心梗后的心功能。本研究結(jié)果顯示,硒缺乏可使大鼠發(fā)生心力衰竭,并伴有Wnt和β-catenin表達(dá)的上調(diào),由此本研究推測(cè)硒缺乏大鼠心力衰竭的發(fā)生與Wnt/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)。

綜上所述,硒缺乏可導(dǎo)致大鼠心功能的下降、心力衰竭的發(fā)生,其可能機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)。這提示抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路則可以阻止硒缺乏導(dǎo)致的心力衰竭的發(fā)生,為治療克山病提供了新的分子策略。