吳瓊娟，楊志鵬，姚焱彬，陸 萍，魏建忠，孫 裴，李 郁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

豬丹毒(swine erysipelas)是由豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種急性、熱性傳染病，臨床癥狀表現(xiàn)為急性敗血型、亞急性疹塊型、慢性心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎型。該病廣泛流行于世界各地，在20世紀(jì)80年代—90年代初，豬丹毒與豬瘟、豬肺疫并稱為我國養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病，帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的發(fā)展、抗生素的大量使用，以及免疫預(yù)防的普及，其危害減輕，防控被忽視。然而，近年來在我國廣西、廣東、四川、福建、江西、安徽、吉林、黑龍江等地均有豬丹毒發(fā)生，且呈逐漸嚴(yán)重之勢[1]。臨床上多見豬紅斑丹毒絲菌與鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬圓環(huán)2型病毒，以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒等混合感染或繼發(fā)感染，致使病情復(fù)雜化，增加了發(fā)病率和病死率[2]。

迄今為止，豬紅斑丹毒絲菌已確認(rèn)的血清型有26種，包括1a、1b、2～24和N型，不同血清型的菌株致病力不同，1a、1b的致病力最強(qiáng)，我國主要為1a型(80%～90%)和2型[3]。一直以來，預(yù)防接種被公認(rèn)為是防治豬丹毒最有效的辦法。豬丹毒傳統(tǒng)疫苗包括豬丹毒滅活菌苗(以2型菌種為主)和弱毒活菌苗(1型或2型菌種均可)。在我國，豬丹毒弱毒活菌苗使用的菌株主要是豬紅斑丹毒絲菌GC42和G4T10弱毒株。豬紅斑丹毒絲菌血清型1型和2型菌苗對其他血清型菌株的感染具有交叉保護(hù)。然而，近年來免疫豬群暴發(fā)豬丹毒的病例越來越多，其病原既有與疫苗血清型一致的菌株，也有不一致的[4]。羅雪剛等[5]研究報道，豬丹毒G4T10活疫苗對多數(shù)菌株缺乏免疫保護(hù)。疫苗菌株的血清型和免疫原性是最根本的原則，為此，本研究擬從豬紅斑丹毒絲菌臨床分離株中，通過致病性試驗、抗原性試驗和穩(wěn)定性試驗，綜合鑒定篩選豬紅斑丹毒絲菌制苗用菌株，旨在提高豬丹毒疫苗的免疫保護(hù)效果，同時也為豬紅斑丹毒絲菌與其他病原聯(lián)合疫苗的研制提供技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 受試菌株

2012年6月—2015年6月從江淮地區(qū)臨床病例中分離鑒定出42株豬紅斑丹毒絲菌，血清型均為1a型[6]。通過小鼠致死性試驗(攻毒劑量為1×102cfu·mL-1)，根據(jù)100%小鼠死亡結(jié)果篩選出編號為AEr9、AEr21、AEr31和AEr32的4株豬紅斑丹毒絲菌作為受試菌株。

1.2 主要試劑

胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)，紹興天恒生物科技有限公司；弗氏佐劑，Sigma公司；犢牛血清，北京元亨金馬生物技術(shù)開發(fā)有限公司；瓊脂糖，南京基天生物有限公司。

1.3 試驗動物

體質(zhì)量18～22 g的無特定病原體級(SPF)、健康狀況良好的雌性昆明小鼠，3～4月齡新西蘭大白兔，均購自安徽醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心。試驗期間室內(nèi)衛(wèi)生良好，保持18～29 ℃的室溫和50%～60%的相對濕度。試驗動物分籠飼養(yǎng)，每天2次添加飼料和水，并對動物的狀態(tài)進(jìn)行觀察，做好試驗記錄。

1.4 抗原和血清

1.4.1 豬紅斑丹毒絲菌抗原

將豬紅斑丹毒絲菌受試菌株接種TSA-YE，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)后的菌落接種于100 mL TSB-YE中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h(150 r·min-1)，將菌液移入50 mL離心管中，12 830g離心10 min，棄上清液，沉淀用30 mL滅菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸，混勻后，經(jīng)12 830g離心10 min，棄上清。重復(fù)3次。最后加入10 mL滅菌PBS重懸沉淀。為充分釋放菌體抗原，選擇超聲破碎方式[7]：超聲3 s，停3 s，振幅30%，超聲20 min，至菌液透明，全程冰浴。

1.4.2 血清

豬紅斑丹毒絲菌陽性血清，參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行。將豬紅斑丹毒絲菌受試菌株接種于TSB-YE中，37 ℃培養(yǎng)8 h，加入0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲醛滅活后，肌肉注射新西蘭大白兔，每只5 mL(2×109cfu·mL-1)，14 d后加強(qiáng)免疫。二免后分別于7、14、21 d自心臟采集兔血，使用沉淀抗體滴度試驗測定血清抗體，當(dāng)沉淀抗體滴度達(dá)到1∶24時，心臟采血，分離血清備用。

豬紅斑丹毒絲菌陰性血清，采集豬紅斑丹毒絲菌抗體陰性的健康兔血清。

1.5 生長曲線測定

按文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行，采用平板計數(shù)法測定菌株的生長曲線。吸取1 mL細(xì)菌種子液于49 mL TSB-YE肉湯中，37 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)。在0～24 h內(nèi)，每隔2 h為一個時間點(diǎn)，無菌取0.1 mL培養(yǎng)菌液涂布平板，每個時間點(diǎn)選擇3個稀釋度，每個稀釋度涂布3塊平板，每個時間點(diǎn)均設(shè)定一個生理鹽水對照，平板于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后計算活菌數(shù)。重復(fù)3次試驗，繪制豬丹毒絲菌受試菌株的生長曲線。

1.6 致病力測定

用遞加法預(yù)試驗測定AEr9、AEr21、AEr31和AEr32的致死劑量LD0和LD100(下標(biāo)的0和100指致死比例)。在LD0和LD100劑量區(qū)間內(nèi)，設(shè)置5個劑量組，相鄰組間劑量設(shè)置參照文獻(xiàn)[9]。將100只小鼠隨機(jī)分為20組，每組5只。根據(jù)生長曲線測定結(jié)果，取振蕩培養(yǎng)8 h的菌液(即接近穩(wěn)定期的對數(shù)生長期菌液)等容量不等濃度接種小鼠，腹腔注射，每只0.2 mL，另設(shè)對照組注射等量滅菌PBS。攻毒后，連續(xù)觀察7 d，記錄發(fā)病及死亡情況，采用改良寇氏法計算AEr9、AEr21、AEr31、AEr32的LD50。將各組LD50分別與中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的LD50進(jìn)行對比后，采用q檢驗(95%置信水平)，計算各組q值，取舍極端值[10]。

1.7 滅活全菌體制備

選出的強(qiáng)致病力菌株分別接種于TSB-YE，37 ℃培養(yǎng)8 h(即接近穩(wěn)定期的對數(shù)生長期菌液)，純粹檢驗合格、細(xì)菌計數(shù)后，調(diào)整菌液濃度至109cfu·mL-1，加入0.2%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液，37 ℃、200 r·min-1振蕩15 h滅活。滅活后取樣接種于TSA-YE，37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌檢驗合格后，取滅活完全的菌液(5 mL)與弗氏佐劑(5 mL)等體積混合，使用醫(yī)用三通管乳化至無分層，安全檢驗后，分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 抗原性測定

1.8.1 微量平板凝集試驗

采用96孔U型凝集板，作好標(biāo)記，每孔中加入豬紅斑丹毒絲菌陽性血清和豬紅斑丹毒絲菌抗原各50 μL，充分混勻，同時設(shè)立陰性對照及抗原對照。置37 ℃溫箱10 min后觀察結(jié)果，并根據(jù)凝集標(biāo)準(zhǔn)判定反應(yīng)結(jié)果[11]。

1.8.2 瓊脂擴(kuò)散試驗

按文獻(xiàn)[7]的方法，瓊脂板中央孔加豬紅斑丹毒絲菌抗原，周邊孔依次加倍比稀釋后的豬紅斑丹毒絲菌陽性血清，在血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)明顯沉淀線者即判為陽性。

1.8.3 免疫保護(hù)性試驗

將小鼠隨機(jī)分組，每組5只。分為免疫組和對照組，對照組又分為攻毒對照組和PBS對照組。免疫組首次免疫于頸部皮下分點(diǎn)注射0.5 mL滅活全菌體，7 d后以同樣劑量和方式加強(qiáng)免疫。攻毒對照組頸部皮下注射等量滅菌PBS。加強(qiáng)免疫7 d后，免疫組和攻毒對照組分別接種豬紅斑丹毒絲菌強(qiáng)致病力菌株，劑量均為100 LD50，腹腔注射；PBS對照組均腹腔注射等量滅菌PBS。記錄14 d內(nèi)小鼠死亡情況，計算免疫保護(hù)率。重復(fù)試驗2次。

1.9 穩(wěn)定性測定

1.9.1 菌株傳代

將篩選的強(qiáng)致病力菌株接種TSA-YE，37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)種，為傳代1次，如此連續(xù)傳代30次。選取第10、20、30代單菌落于TSB-YE中進(jìn)行增菌培養(yǎng)[12]。

1.9.2 致病性試驗

分別測定第10、20、30代篩選的受試菌株LD50，方法同1.6節(jié)。

1.9.3 抗原性試驗

分別用篩選的受試菌株第10、20、30代制備滅活全菌體(方法同1.7節(jié))，再獲取兔抗豬丹毒血清，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(方法同1.8.2節(jié))。

1.9.4 免疫保護(hù)性試驗

在用篩選的受試菌株第10、20、30代制備滅活全菌體的基礎(chǔ)上，測定小鼠的免疫保護(hù)率，方法同1.8.3節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線測定

受試菌株AEr9、AEr21、AEr31和AEr32的生長曲線均表現(xiàn)出明顯的遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期，在培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對數(shù)期，8～10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1)。由此選擇培養(yǎng)8 h的細(xì)菌進(jìn)行攻毒試驗。

2.2 致病力測定

小鼠在受試菌株AEr9、AEr21、AEr31、AEr32攻毒后：1 d，均表現(xiàn)精神萎靡，食欲下降，被毛松亂；3～4 d，AEr9、AEr21、AEr31組開始出現(xiàn)死亡；4～5 d，試驗組均出現(xiàn)死亡，PBS對照組均正常；AEr21、AEr31和AEr32組的死亡率為60%，AEr9組為80%；7 d后各組小鼠不再死亡。剖檢死亡小鼠均見脾臟腫大，肝臟壞死并伴有點(diǎn)狀出血，肺臟出血、壞死，并從肝臟、脾臟中均成功分離到豬紅斑丹毒絲菌。對照組小鼠未見異常。受試菌株AEr9、AEr21、AEr31和AEr32 的LD50見表1。q檢驗結(jié)果顯示，AEr9的LD50(q=0.95)>95%置信水平(q95%=0.73)，予以舍棄，篩選出AEr21、AEr31和AEr32進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 4株豬紅斑丹毒絲菌生長曲線Fig.1 Growth curves of four Erysipelothrix rhusiopathiae

2.3 滅活全菌體制備

3株受試菌株AEr21、AEr31和AEr32滅活前純粹檢驗合格，活菌數(shù)分別為5.30×108、4.30×108和2.00×108cfu·mL-1，將菌液濃度濃縮調(diào)整至109cfu·mL-1。滅活后無菌檢驗合格。皮下注射小鼠3只，各1 mL，觀察7 d[13]，小鼠均健活，安全檢驗合格。滅活全菌體分別編號為V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32。

2.4 抗原性測定

利用篩選出的3株受試菌株AEr21、AEr31和AEr32制備豬紅斑丹毒絲菌抗原(按1.4.1節(jié)方法進(jìn)行，編號分別為Ag-AEr21、Ag-AEr31和Ag-AEr32)和豬紅斑丹毒絲菌陽性血清(按1.4.2節(jié)方法進(jìn)行，編號分別為Ab-AEr21、Ab-AEr31和Ab-AEr32)。

表14株豬紅斑丹毒絲菌受試菌株的LD50

Table1LD50result of 4Erysipelothrixrhusiopathiaetested strains

菌株Strains接種劑量Inoculating dose/(cfu·mL-1)動物數(shù)Mice No.死亡數(shù)Death No.死亡率Death rate/%LD50/(cfu·mL-1)q值q valueAEr94.10×103551008450.952.25×103551001.26×10354807.10×10252404.21×102500AEr214.10×1045510050.34.00×10-67.10×103551001.26×10354802.25×102548035500AEr314.00×1035510035.51.70×10-21.26×10354804.00×10254801.26×102536043500AEr324.00×1035510010.14.80×10-21.26×103551004.00×10254801.26×102536041500標(biāo)準(zhǔn)菌————50—Standard strain

2.4.1 微量平板凝集試驗

滅活全菌體V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32均能誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生特異性抗體，發(fā)生平板凝集現(xiàn)象。陽性血清Ab-AEr21、Ab-AEr31與3株豬紅斑丹毒絲菌抗原的凝集效價為50%～75%，Ab-AEr32與抗原Ag-AEr21、Ag-AEr31凝集效價僅為0～25%(表2)。

2.4.2 瓊脂擴(kuò)散試驗

Ab-AEr21與Ag-AEr21、Ab-AEr31與Ag-AEr31、Ab-AEr32與Ag-AEr32之間均出現(xiàn)白色的抗原抗體沉淀線，血清Ab-AEr21、Ab-AEr31沉淀抗體滴度均可達(dá)到1∶24，Ab-AEr32則為1∶23(圖2)。

2.4.3 免疫保護(hù)性試驗

滅活全菌體V-AEr21和V-AEr31均產(chǎn)生免疫保護(hù)效力(表3)。V-AEr21作為免疫原，使用AEr21、AEr31攻毒時免疫保護(hù)率均高于80%；V-AEr31作為免疫原，使用AEr21、AEr31攻毒時，對AEr31完全保護(hù)(100%)，對AEr21免疫保護(hù)力較差(60%)；V-AEr32作為免疫原，使用AEr21、AEr31攻毒時，對AEr21、AEr31免疫保護(hù)力均較差(60%)，攻毒對照組小鼠7 d之內(nèi)全部死亡。腹腔注射滅菌PBS對照組小鼠一切正常。通過綜合分析3株菌的反應(yīng)原性和免疫原性，舍棄菌株AEr32，篩選出受試菌株AEr21和AEr31進(jìn)行后續(xù)試驗。

表23株豬紅斑丹毒絲菌抗原與陽性血清的微量平板凝集試驗結(jié)果

Table2Antigen and antibody agglutination results of 3Erysipelothrixrhusiopathiaestrains

豬紅斑丹毒絲菌陽性血清Positive serum豬紅斑丹毒絲菌抗原Erysipelothrix rhusiopathiae antigenAg-AEr21Ag-AEr31Ag-AEr32豬紅斑丹毒絲菌陰性血清Negative serumAb-AEr21+++++++—++++++++—++++++++—Ab-AEr31+++++++—++++++++—+++++++—Ab-AEr32+—++—++++—+++++—

+++，有著明顯凝集現(xiàn)象出現(xiàn)、液體幾乎完全透明，即75%凝集；++，有肉眼可見的凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，液體透明度不高，即50%凝集；+，液體呈現(xiàn)混濁并且伴有較小的顆粒狀物出現(xiàn)，即25%凝集；-，液體均勻混濁，無凝集物。

+++， With obvious agglutination occurred， the liquid was almost completely transparent， namely， 75% agglutination; ++， Agglutination with macroscopic appeared， the liquid was not transparent， namely， 50% agglutination;+， The liquid appeared cloudy and accompanied by the appearance of smaller particles， namely， 25% agglutination; -， Liquid was cloudy and free of agglomerates.

A、B、C分別為AEr21、AEr31、AEr32。0，抗原；1-5，分別表示陽性血清稀釋比1∶1、1∶2、1∶22、1∶23、1∶24；6，陰性血清。A， B， C， AEr21， AEr31， AEr32， respectively. 0， Antigens; 1-5， Dilution ratio of positive serum as 1∶1， 1∶2， 1∶22， 1∶23， 1∶24， respectively; 6， Negative serum.圖2 Ab-AEr21、Ab-AEr31、Ab-AEr32沉淀抗體滴度測定Fig.2 Precipitation antibody titer of Ab-AEr21， Ab-AEr31， Ab-AEr32

表3豬紅斑丹毒絲菌滅活全菌體免疫保護(hù)效果

Table3Protection effect of inactivated oil-emulsion vaccine

免疫組別Vaccinationgroups免疫劑量Vaccinationroute/mL攻毒菌株Challengestrains攻毒劑量Toxicdose/mL免疫保護(hù)率Protectiverate/%攻毒對照組死亡率Mortality rate ofchallenge control/%PBS對照組死亡率Mortality rate ofPBS control/%V-AEr210.5AEr210.21001000AEr31801000V-AEr31AEr21601000AEr311001000V-AEr32AEr21601000AEr31601000

2.5 穩(wěn)定性測定

2.5.1 致病性試驗

第10、20、30代的受試菌株AEr21和AEr31的LD50值(圖3)顯示：AEr31第10代LD50為103.64cfu·mL-1，隨著繼續(xù)傳代至第30代，該菌株致病力趨于穩(wěn)定。與此同時，AEr21第10代LD50為103.39cfu·mL-1，傳代至10代之后致病力也趨于穩(wěn)定。

2.5.2 抗原性試驗

30代內(nèi)豬紅斑丹毒絲菌滅活全菌體均可誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生特異性抗體。第10代滅活全菌體V-AEr21組誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生的沉淀抗體滴度為1∶24，隨著傳代數(shù)增加沉淀抗體滴度降低，最終達(dá)1∶22。第10、20代滅活全菌體V-AEr31組誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生的沉淀抗體滴度為1∶23，隨著傳代數(shù)增加至第30代，沉淀抗體滴度降到1∶22(圖4)。

2.5.3 免疫保護(hù)性試驗

不同傳代數(shù)滅活全菌體均有免疫保護(hù)效果(圖5)。以AEr21作為攻毒菌株，滅活全菌體V-AEr21第10、20代的免疫保護(hù)率為100%，第30代免疫保護(hù)率為80%，始終高于AEr31(60%)；以AEr31作為攻毒菌株，滅活全菌體V-AEr31在第10、20、30代的免疫保護(hù)率始終高于AEr21，并且AEr21的免疫保護(hù)率在第30代低至40%。攻毒對照組小鼠7 d之內(nèi)全部死亡。PBS對照組小鼠未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀。

圖3 第10、20、30代的受試菌株AEr21和AEr31的LD50Fig.3 LD50 values of 10th， 20th， 30th generation strains of AEr21 and AEr31

圖4 V-AEr21(A)和V-AEr31(B)免疫組二次免疫后沉淀抗體滴度水平Fig.4 Level of precipitation antibody titer after the second immunization in V-AEr21(A) and V-AEr31(B) group

圖5 V-AEr21、V-AEr31對AEr21、AEr31攻毒后的小鼠免疫保護(hù)率Fig.5 Protective rate of V-AEr21 and V-AEr31 in mice following Erysipelothrix rhusiopathiae AEr21 and AEr31 challenge

3 討論

自20世紀(jì)90年代后期到2011年，豬丹毒極少有發(fā)生和報道，基本處于“絕跡”狀態(tài)，但在2012年，該病突然在我國多地暴發(fā)或散發(fā)，并呈現(xiàn)發(fā)病增多的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，3月齡以下的仔豬由于被動獲得性免疫的免疫保護(hù)效應(yīng)、3 a以上的豬由于亞臨床疾病的反復(fù)發(fā)生，通常情況下都極少誘發(fā)豬丹毒，這說明豬丹毒的發(fā)生及發(fā)病率、死亡率主要取決于豬群的免疫狀態(tài)，機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫在宿主對抗豬紅斑丹毒絲菌感染過程中起著非常重要的作用[14]。因此，疫苗免疫接種是預(yù)防豬丹毒發(fā)生的廣泛而有效的辦法。目前使用的豬丹毒疫苗主要是弱毒疫苗和滅活疫苗。弱毒疫苗抗體產(chǎn)生速度快、持續(xù)時間長[15]，但易受母源抗體和抗生素使用的影響，并存在弱毒株毒力返強(qiáng)的可能性，有可能增加慢性疾病的發(fā)作[16-17]。滅活疫苗在安全性上較弱毒疫苗更有優(yōu)勢，具有母源抗體干擾小、疫苗相對穩(wěn)定、使用方便、易于制備多聯(lián)疫苗等優(yōu)點(diǎn)，但存在抗原性低、免疫效力不足、免疫維持時間短等問題。細(xì)菌滅活疫苗的免疫效果與其制苗菌株的特性有關(guān)，即在來源清楚、資料完整、生物學(xué)特性典型的基礎(chǔ)上，不僅需要菌株的毒力強(qiáng)，而且應(yīng)有良好的抗原性，同時在傳代增殖過程中應(yīng)表現(xiàn)出相對的純一和穩(wěn)定性。因此，細(xì)菌滅活疫苗用菌株的篩選程序包括致病力試驗、抗原性試驗和穩(wěn)定性試驗，最后綜合確定[18-20]。

病原細(xì)菌致病能力的強(qiáng)弱程度稱為致病力或毒力，通常以LD50衡量。研究表明，豬紅斑丹毒絲菌的致病力會因來源、環(huán)境、動物品系、分離部位等的不同而不同[13]。本試驗從42株豬紅斑丹毒絲菌臨床分離株中通過小鼠致死性試驗篩選出4株受試菌株(AEr9、AEr21、AEr31和AEr32)，LD50的測定結(jié)果分別為845、50.3、35.5、10.1 cfu·mL-1，菌株之間毒力存在差異，經(jīng)q檢驗分析，AEr9的致病力與標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株差距過大，故選用AEr21、AEr31、AEr32菌株繼續(xù)進(jìn)行抗原性試驗。

抗原性是制苗用菌株的重要指標(biāo)。豬紅斑丹毒絲菌抗原性受多方面因素影響，鄒垚[21]發(fā)現(xiàn)豬紅斑丹毒絲菌不同毒力菌株的免疫特性差異較大。此外，豬紅斑丹毒絲菌的抗原性還受到培養(yǎng)基質(zhì)量和培養(yǎng)方法的影響[22]?？乖园庖咴院头磻?yīng)原性。免疫原性是抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性，通常采取動物免疫攻毒試驗，以保護(hù)率表示。反應(yīng)原性是抗原與其所刺激產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的特性，通常采取體外血清學(xué)方法，以抗體滴度或效價表示。本試驗中，免疫原性采用滅活全菌體免疫保護(hù)性試驗測定，反應(yīng)原性則是采用平板凝集試驗和瓊脂擴(kuò)散試驗測定。滅活全菌體V-AEr21、V-AEr31、V-AEr32不僅能誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生血清抗體，而且對豬丹毒絲菌強(qiáng)毒株的攻擊具有很好的保護(hù)力。但各個菌株之間的免疫原性存在差異：Ab-AEr32與Ag-AEr21、Ag-AEr31抗原凝集效價僅為0～25%； Ab-AEr21、Ab-AEr31血清沉淀抗體滴度雖可達(dá)到1∶24，但滅活全菌體V-AEr21保護(hù)力強(qiáng)于V-AEr31。表明菌株抗原Ag-AEr21、Ag-AEr31、Ag-AEr32進(jìn)入機(jī)體雖均可引起免疫應(yīng)答反應(yīng)，但免疫應(yīng)答強(qiáng)度存在差異，其中，AEr21抗原性最強(qiáng)，AEr31次之，AEr32最弱。由此選出AEr21和AEr31菌株繼續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。

制苗用菌株遺傳性狀的穩(wěn)定是保證其相對純一的基礎(chǔ)，包括毒力特性和抗原性等方面，這是生產(chǎn)安全性、有效性和高產(chǎn)性疫苗的重要保證。本試驗中，菌株AEr21、AEr31均隨著傳代增加致病力減弱，10代后趨于平穩(wěn)。Ab-AEr21、Ab-AEr31血清沉淀抗體滴度在10代之內(nèi)均達(dá)到1∶24，隨著傳代數(shù)的增加降低至1∶22。滅活全菌體V-AEr21、V-AEr31在20代之前免疫保護(hù)率均能達(dá)到60%，然而第30代的AEr21免疫保護(hù)率低至40%。

穩(wěn)定性試驗中，培養(yǎng)10代內(nèi)AEr21、AEr31均出現(xiàn)致病力減弱的情況，10代后趨于平穩(wěn)，可能的原因是：在連續(xù)傳代過程中，豬紅斑丹毒絲菌的體外培養(yǎng)環(huán)境相對體內(nèi)差距較大，為了適應(yīng)培養(yǎng)基的環(huán)境而發(fā)生突變，在對新的或具有挑戰(zhàn)性的環(huán)境適應(yīng)后，能夠自發(fā)地產(chǎn)生增變基因，增加基因的自發(fā)突變頻率[23-24]，而在適應(yīng)培養(yǎng)基環(huán)境后毒力逐漸趨于平穩(wěn)。AEr21、AEr31的抗原性在10代之內(nèi)無明顯變化，表明菌株在10代之內(nèi)抗原性穩(wěn)定，而在10代之后開始出現(xiàn)下降，甚至AEr31第30代免疫保護(hù)率降到40%。一方面，可能是因為豬紅斑丹毒絲菌在體外連續(xù)傳代過程中，菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[25]，菌體出現(xiàn)損傷，部分組分發(fā)生改變，導(dǎo)致刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞的能力減弱；另一方面，人工培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分及pH值會對豬丹毒疫苗菌株的免疫原性產(chǎn)生較大影響[26]，造成免疫效力的下降。因此，在實際應(yīng)用時，豬紅斑丹毒絲菌人工體外培養(yǎng)不應(yīng)超過10代，可及時選用易感動物進(jìn)行復(fù)壯。

本研究利用江淮地區(qū)臨床分離的豬紅斑丹毒絲菌，根據(jù)制苗用菌種的選擇和鑒定要求，綜合篩選出致病力強(qiáng)、抗原性好和遺傳穩(wěn)定的2株菌株(AEr21和AEr31)，可為研制高效豬丹毒疫苗以及研發(fā)多聯(lián)疫苗、加強(qiáng)豬丹毒的有效防控提供技術(shù)儲備。