陳劍松，周海云

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.中山大學(xué)測試中心，廣東 廣州 510275)

磷脂(phospholipids)是生物膜的主要組成成分，存在于真核生物和原核生物體內(nèi)[1]。磷脂在細(xì)胞調(diào)控以及輔助因子方面起著重要的作用[2-4]，它們與人體的多種疾病，如癌癥[5]、阿爾茨海默病[6]、糖尿病[7]等息息相關(guān)。磷脂組學(xué)作為闡述磷脂生物學(xué)意義的一種方法，其中化合物的提取、分離與檢測是分析流程的關(guān)鍵步驟[8]。研究者們提出許多不同的脂類提取方法，其中最典型的是兩相萃取法和單相沉淀法?；贔olch等[9]和Bligh等[10]報(bào)道的“金標(biāo)準(zhǔn)”法，趙素敏等[11]對血漿中的磷脂進(jìn)行提取，其步驟可概括為甲醇沉淀蛋白、氯仿萃取磷脂、靜置孵化、添加水相誘導(dǎo)分層、移取有機(jī)相、減壓蒸干并復(fù)溶有機(jī)相。然而，氯仿具有劇毒性、致癌性和受管控等缺點(diǎn)，Matyash等[12]報(bào)道的MTBE法中采用甲基叔丁基醚作為氯仿的替代試劑提取磷脂，但不可避免的是，兩相萃取法的操作繁瑣、時(shí)間成本高，不利于高通量組學(xué)分析。為了建立一種高效穩(wěn)健的脂類提取方法，Sarafian等[13]對單相沉淀法和兩相萃取法進(jìn)行了綜合分析，總結(jié)出單相沉淀法較兩相萃取法省時(shí)簡便，同時(shí)提出異丙醇是一種脂質(zhì)種類覆蓋率較優(yōu)的提取溶劑；Satomi等[14]使用醇類溶劑對小鼠全血進(jìn)行提取，該方法表明，醇類溶劑對中性甘油酯的提取效率整體優(yōu)于乙腈。因此，單相沉淀法相比于兩相萃取法省去了分層、干燥與復(fù)溶的步驟，大大節(jié)約了分析時(shí)間，但上述研究都沒有提出適合磷脂分析的有效提取方法與分離條件。盡管Zhao等[15]和Zhu等[16]分別報(bào)道了采用甲醇或異丙醇沉淀蛋白對全血或血清磷脂進(jìn)行分析的方法，但未對其他有機(jī)溶劑進(jìn)行考察。

本研究擬采用時(shí)間成本低、高通量的單相沉淀法對單相提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，基于超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)，優(yōu)化選擇適用于磷脂分析的流動相，并結(jié)合超聲波輔助萃取手段[17-18]，選擇適用于磷脂的提取溶劑，建立一種簡便、高效的磷脂前處理分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

Acquity I-Class型超高效液相色譜儀、SYNAPT G2-Si HDMS離子淌度四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

小鼠血清：購自中科晨宇(北京)貿(mào)易有限公司，于-20 ℃冷凍貯藏。

乙腈、甲醇、異丙醇：均為色譜純，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；甲基叔丁基醚：色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸：質(zhì)譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；超純水：由Milli-Q系統(tǒng)制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品預(yù)處理 向0.1 mL小鼠血清中加入0.5 mL 4 ℃預(yù)冷的溶劑系統(tǒng)(分別為甲醇-乙腈(1∶9，V/V)、甲醇、甲醇-甲基叔丁醚(1∶3，V/V)、甲基叔丁基醚)，超聲2 min，于-20 ℃靜置10 min，在4 ℃下，以12 000 r/min離心15 min，等量(100 μL)移取上清液，揮干后以0.1 mL甲醇復(fù)溶，每組測定5個(gè)平行樣。

1.3.2色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；柱溫38 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；流速400 μL/min；流動相：A為超純水(含0.1%甲酸)， B為含0.1%甲酸的乙腈-異丙醇溶液(50∶50，V/V)；梯度洗脫程序：0～1 min(5%～25%B)，1～6 min(25%～60%B)，6～15 min(60%～90%B)，15～17 min(90%～95%B)，17～20 min(95%～98%B)，20～22 min(98%B)，22.1～25 min(5%B)。

1.3.3質(zhì)譜條件 ESI模式參數(shù)：毛細(xì)管電壓±2.5 kV；霧化氣和錐孔氣為氮?dú)?；霧化氣壓強(qiáng)0.6 MPa；錐孔電壓40 V；反向錐孔氣流速40 L/h；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速700 L/h。質(zhì)譜采集為MSE模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500；掃描時(shí)間0.3 s；MS/MS Trap高能碰撞能量25～60 eV。

Lock mass校正液為1 μg/L亮氨酸腦啡肽(556.277 1(+)/554.261 5(-))，數(shù)據(jù)采集過程中并行采集。

1.3.4數(shù)據(jù)處理 利用MasslynxV4.1軟件(Waters, USA)采集原始數(shù)據(jù)，通過將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI(Nonlinear Dynamics, Waters, UK)軟件進(jìn)行濾噪、峰匹配、峰提取操作后，采用EZinfo 3.0 for Waters(Umetrics, Sweden)軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。磷脂化合物鑒定分析基于磷脂裂解規(guī)律[19]與在線數(shù)據(jù)庫METLIN[20]metabolite MSMS database(http:∥metlin.scripps.edu)和LipidMaps[21](http:∥www.lipidmaps.org)，通過高分辨質(zhì)譜采集的精確質(zhì)量數(shù)及其二級離子碎片進(jìn)行化合物確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相系統(tǒng)對磷脂分離的影響

磷脂化合物由溶血性磷脂與磷脂組成，隨著分子質(zhì)量及飽和度的增加，它們在反相色譜柱上的保留時(shí)間增長，這要求溶劑的洗脫能力增強(qiáng)。用于脂質(zhì)組學(xué)分析的反相色譜法的流動相系統(tǒng)通常為乙腈-異丙醇溶液(1∶9，V/V)[13,22-23]，該系統(tǒng)可有效地分離總脂，但對于溶血性磷脂而言，洗脫能力過強(qiáng)，會導(dǎo)致其共流出而形成多成分峰。因此，為了更好地分離溶血性磷脂與磷脂，本研究以H2O為流動相A，探討乙腈[24]、乙腈-異丙醇(95∶5，V/V)、乙腈-異丙醇(50∶50，V/V)3組不同的流動相B對磷脂的分離效果，其中A、B兩相均含0.1%甲酸，所得色譜圖示于圖1。可見，乙腈組可以洗脫極性較大的溶血性磷脂，但對于大分子質(zhì)量磷脂的分離與洗脫表現(xiàn)不佳，在柱上殘留嚴(yán)重，多次重復(fù)測試后，磷脂殘留疊加，使得樣本之間交叉污染，鑒定結(jié)果為假陽性，不利于后續(xù)多元統(tǒng)計(jì)分析；對于大分子質(zhì)量磷脂，乙腈-異丙醇(95∶5，V/V)組比乙腈組的分離能力強(qiáng)，但在保留時(shí)間17～18 min內(nèi)的2個(gè)色譜峰為多組分峰；乙腈-異丙醇(50∶50，V/V)組不僅能夠有效地分離溶血性磷脂，同時(shí)對大分子質(zhì)量磷脂表現(xiàn)出較好的分離能力和洗脫效果，比乙腈-異丙醇(95∶5，V/V)組能夠更有效地分離多組分峰，并且避免了分離不充分帶來的樣本間交叉污染。重現(xiàn)性是大批量樣品分析的前提，因此選擇乙腈-異丙醇(50∶50，

注：a1.乙腈；a2，b2. 乙腈-異丙醇(95∶5，V/V)；a3，b1.乙腈-異丙醇(50∶50，V/V) 圖1 不同流動相組成分離磷脂化合物的基峰色譜圖(a)和局部放大圖(b)Fig.1 Base peak intensity chromatograms (a) of different mobile-phase and partial enlargement (b)

V/V)組進(jìn)行重現(xiàn)性考察，連續(xù)進(jìn)樣5針后，隨機(jī)選取多組峰的保留時(shí)間及峰面積計(jì)算RSD值。結(jié)果表明，保留時(shí)間RSD值均小于0.1%，峰面積RSD值均小于10%，說明該方法的重現(xiàn)性較好。本實(shí)驗(yàn)最終確定流動相A為含0.1%甲酸水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈-異丙醇溶液(50∶50，V/V)。

2.2 血清預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1血清預(yù)處理溶劑系統(tǒng) 本研究采用甲醇-乙腈(1∶9，V/V)(a)、甲醇(b)、甲醇-甲基叔丁醚(1∶3，V/V)(c)、甲基叔丁基醚(d) 4種不同溶劑系統(tǒng)進(jìn)行血清磷脂化合物的提取，在正、負(fù)離子模式下，獲得的典型脂質(zhì)化合物的熱圖示于圖2a、2b。由圖可見，由于d組采用極性較弱的甲基叔丁基醚作為提取溶劑，相對于a、b、c組而言，有較高的甘油酯與長鏈脂肪酸提取效率，但不適合提取磷脂化合物；a組對磷脂化合物覆蓋率較b、c組高，同時(shí)又能很好地去除干擾性非磷脂類化合物，如甘油酯與脂肪酸。

為了探討4種提取溶劑系統(tǒng)提取結(jié)果的差異性與重復(fù)性，對不同處理方法所得的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析，其得分圖示于圖2c、2d。在正離子模式下，可明顯地觀察到不同的溶劑系統(tǒng)存在差異性，其中以d組與其他溶劑組的差異最為明顯；在負(fù)離子模式下，組間差異顯示，a、b、c三組無顯著區(qū)別，但d組與其他溶劑組的差異很明顯；結(jié)合正負(fù)離子模式，a組相對于其他溶劑組更為聚集，表明該組重現(xiàn)性較其他溶劑組更佳。正、負(fù)離子模式下的載荷圖示于圖2e、2f，由圖可見，在正離子模式下，靠近d組的離子主要為弱極性化合物甘油酯類等，而靠近其他組的離子主要為磷脂化合物；在負(fù)離子模式下，靠近d組的離子相對減少，化合物主要集中在a、b、c三組，表明這三組溶劑系統(tǒng)提取磷脂化合物的效率高于d組。從方法簡便性的角度考慮，采用a、b兩組可省去干燥、復(fù)溶兩大步驟，避免了磷脂成分損失。綜上，本研究選擇了方法簡便、重復(fù)性良好和磷脂提取效率較高的甲醇-乙腈作為血清預(yù)處理溶劑系統(tǒng)。

2.2.2超聲輔助提取時(shí)間 渦旋和超聲同樣有助于化合物的提取，但長時(shí)間的渦旋相比于短時(shí)間的超聲提取效率并無顯著性差異，且增加了時(shí)間成本[17-18]。超聲輔助提取的時(shí)間長短同樣影響著提取結(jié)果，分別對提取時(shí)間為2、10、30 min進(jìn)行考察，每組測定5份平行樣。將所得數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行PCA分析，結(jié)果示于圖3?？梢姡晻r(shí)間的延長并未帶來提取效率的顯著性差異，對于磷脂的提取而言，超聲2 min足以提取充分，且時(shí)間成本低，有助于高通量分析。

注：a.正離子模式下典型脂質(zhì)化合物的熱圖；b.負(fù)離子模式下典型脂質(zhì)化合物的熱圖； c.正離子模式下的得分圖；d.負(fù)離子模式下的得分圖；e.正離子模式下的載荷圖；f.負(fù)離子模式下的載荷圖； A.甲醇-乙腈(1∶9，V/V)；B.甲醇；C.甲醇-甲基叔丁基醚(1∶3，V/V)；D.甲基叔丁基醚 圖2 不同溶劑系統(tǒng)對磷脂化合物提取效率的影響Fig.2 Effect of different solvent systems on phospholipids extraction ability

2.3 數(shù)據(jù)可靠性分析

在運(yùn)行磷脂組學(xué)分析方法的過程中，存在基質(zhì)以及本底信號的干擾，重現(xiàn)性及穩(wěn)定性會受到影響。本實(shí)驗(yàn)采用模式識別方法(主成分分析)驗(yàn)證該方法的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性[25]。分別移取10 μL 4個(gè)不同溶劑提取組樣品，混合作為QC組，在分析過程中，對系統(tǒng)進(jìn)行平衡后(連續(xù)進(jìn)行10次QC樣品測試)，每組序列后穿插一次QC樣本的測定(n=5)。圖2c、2d展示了正負(fù)離子模式下的QC樣本聚集情況，說明儀器狀態(tài)穩(wěn)定，樣本重現(xiàn)性良好；正負(fù)離子模式下，QC樣本在第一主成分t[1]、第二主成分t[2]、第三主成分t[3]的投影結(jié)果示于圖4。結(jié)果表明，QC樣本均落在±2SD區(qū)間內(nèi)，而數(shù)據(jù)可靠性接受區(qū)間為±3SD，因此，該方法穩(wěn)定性良好，可用于磷脂組學(xué)的研究。

注：a.正離子模式；b.負(fù)離子模式 圖3 不同超聲輔助提取時(shí)間的得分圖Fig.3 Scores plots of different ultrasonic times

注：a.正離子模式；b.負(fù)離子模式 圖4 QC樣本在不同主成分的投影分?jǐn)?shù)圖Fig.4 Principal component scores plots of QC samples

2.4 應(yīng)用

優(yōu)化后的前處理方法：向100 μL血清中加入500 μL 4 ℃預(yù)冷的甲醇-乙腈溶液(1∶9，V/V)，超聲2 min后于-20 ℃靜置10 min，在4 ℃下，以12 000 r/min離心15 min，取100 μL上清液進(jìn)行測試。為了驗(yàn)證方法的適用性，將該方法用于代謝組學(xué)研究中常用的血液樣本小鼠血清、大鼠血清、人血清以及與食品質(zhì)量安全息息相關(guān)的雞禽全血[26]的磷脂分析，結(jié)果示于圖5?？梢?，該方法適用于以上不同來源的樣本分析，整體上表現(xiàn)為不同的色譜峰形，表明差異性的存在。

采用該方法對臨床病人血清樣本進(jìn)行磷脂組學(xué)分析，得分圖示于圖5e、5f。圖中QC樣本聚集在中心，表明在分析過程中該方法穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)可靠，而分散程度較大的臨床樣本進(jìn)一步證明了人個(gè)體差異大的客觀事實(shí)，可為獲得合適的疾病模型提供初步參考。結(jié)合MSE模式、Progenesis QI與數(shù)據(jù)庫LipidMaps，鑒定的磷脂包括PC、PE、PI、PG、PA、PS、SM七大類，在正、負(fù)離子模式下的鑒定數(shù)目分別為302、626個(gè)。

3 結(jié)論

基于超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的磷脂組學(xué)分析方法，首先對流動相系統(tǒng)進(jìn)行確定，其次對小鼠血清預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，包括提取溶劑系統(tǒng)的選擇、超聲時(shí)間的優(yōu)化，最后利用本方法進(jìn)行不同種類血樣的磷脂組學(xué)分析并對方法的實(shí)用性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，本方法不僅具有簡便、重現(xiàn)性良好、磷脂提取效率高以及時(shí)間成本低、高通量的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還適用于不同種類血樣和大批量臨床樣本的磷脂組學(xué)研究。

注：a.小鼠血清；b.大鼠血清；c.人血清；d.雞禽全血；e.正離子模式；f.負(fù)離子模式 圖5 不同來源血樣的基峰色譜圖和臨床樣本在正負(fù)離子模式的得分圖Fig.5 Base peak intensity chromatograms of four kinds of blood sample and score plots of clinical sample at ESI+ and ESI- mode