鄧 超，張 偉，黃 挺，張 輝，何雅娟，陶 紅，全 燦，李紅梅

(1.浙江省計量科學研究院，浙江 杭州 310018； 2.中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，北京 100029)

蘇丹紅Ⅱ作為蘇丹紅Ⅰ的衍生物，是一種偶氮化合物類合成色素[1]，主要用于紡織品、橡膠、塑料、油漆等工業(yè)產(chǎn)品的著色[2]。由于其含有芳香族結構，進入人體后會分解還原成芳香胺，芳香胺化合物再次被人體吸收[3]，對人體健康具有潛在的致癌性[4]。中國和歐盟均禁止將蘇丹紅色素作為食品添加劑使用[5-6]，但因其成本低[7]、著色性好，仍被很多商家非法使用[8]。因此，食品中蘇丹紅色素的檢測極為重要[5,9]。

純度標準物質是溶液和基體標準物質制備的基礎，是基體中目標物準確測量的溯源源頭[10]。若純物質的純度或其中的雜質得不到準確定值，將會對整個國家化學成分測量的量值傳遞和測量結果產(chǎn)生極其嚴重的影響，因此，實現(xiàn)純物質中雜質的準確定性和定量一直是分析測試領域急需攻克的難題[11]。蘇丹紅純度標準物質的研制有利于提高檢測水平與檢測準確度，提高食品質量，有利于保護人民的身體健康，具有廣泛的社會效益和一定的經(jīng)濟效益。但目前國內尚無蘇丹紅Ⅱ純度標準物質，也無蘇丹紅Ⅱ中存在的有機雜質的報道。

本實驗擬采用高效液相色譜-電噴霧-離子阱-飛行時間高分辨質譜(HPLC-ESI-IT-TOF MS)法，通過優(yōu)化液相色譜分離及質譜檢測條件，對蘇丹紅Ⅱ中主要的有機雜質進行分析鑒定，并利用液相色譜外標法準確定量，希望為蘇丹紅Ⅱ一級標準物質的研制提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-離子阱-飛行時間/串聯(lián)質譜儀(配有ESI源)、LC-20AD液相色譜儀：均為日本Shimadzu公司產(chǎn)品；6410QQQ液相色譜-三重四極桿質譜儀、1200型高效液相色譜儀(配有二極管陣列(DAD)檢測器)：美國Agilent公司產(chǎn)品；XP205型稱量天平(0.01 mg)：瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；Inertsil ODS-SP液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)：日本GL Science公司產(chǎn)品。

蘇丹紅Ⅱ標準物質候選物原料：美國Sigma公司產(chǎn)品，經(jīng)柱層析方法提純后使用，經(jīng)液相色譜比較確認無新雜質引入；蘇丹紅Ⅰ(GB W10056，99.9%)：由國家標準物質研究中心提供；溶劑橙2：日本TCI公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸(LC/MS級)：美國Thermo公司產(chǎn)品；流動相用水為二次去離子水。

1.2 樣品溶液和標準溶液的配制

待測樣品溶液和標準溶液均采用質量法配制，以乙腈為溶劑，所有樣品及標準儲備溶液均于4 ℃下密封保存。

1.3 分析方法及實驗條件

1.3.1有機雜質定性分析 采用HPLC-IT-TOF MS法和HPLC-MS/MS法對主成分中的有機雜質進行定性分析，借助質譜儀的高分辨率和精確質量數(shù)優(yōu)勢，由雜質化合物各級質譜碎片的測量值、化學式和理論值，推測雜質的分子式和結構。

1) HPLC-IT-TOF MS實驗條件

液相色譜條件：Inertsil ODS-SP液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈(25∶75，V/V)；流速0.6 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長范圍190～600 nm；進樣量10 μL。

質譜條件：ESI離子源，正離子模式；質量掃描范圍m/z100～600；離子源溫度200 ℃；曲型脫溶劑管(CDL)溫度200 ℃；霧化氣(N2)流速1.5 L/min；碰撞能量為MS150%，MS270%；離子分離時間50 ms；碰撞氣及冷卻氣為高純氬氣。

2) HPLC-MS/MS實驗條件

液相色譜條件：流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，其他同HPLC-IT-TOF MS色譜條件。

質譜條件：ESI離子源；全掃描模式和子離子監(jiān)測模式，正離子掃描監(jiān)測；出口電壓135 V，雜質1～4和蘇丹紅Ⅱ的碰撞能依次為16、15、10、10、10 eV；干燥氣流速8 L/min；干燥氣溫度350 ℃；霧化氣壓力3.45×105Pa；碰撞氣為高純氮氣。

1.3.2雜質純品純度定值HPLC條件 雜質純品作為對雜質定量的標準品，實驗前需確定準確純度。溶劑橙2因無相應的標準物質，故其標準品經(jīng)液相色譜面積歸一化法確定其準確純度。對配制的6份溶劑橙2樣品溶液進行液相色譜檢測，積分得到其有機純度值。

液相色譜條件：Inertsil ODS-SP 液相色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相為純水-乙腈(30∶70,V/V)；流速1 mL/min；檢測波長范圍190～400 nm；進樣量10 μL。

1.3.3有機雜質定量分析 采用液相色譜HPLC外標曲線法對蘇丹紅Ⅱ純品中已確定的有機雜質進行定量分析。繪制蘇丹紅Ⅰ雜質標準曲線(0.01～2 mg/L)和溶劑橙2雜質標準曲線(0.19～4.652 mg/L)，配制6份蘇丹紅Ⅱ溶液，分別進行HPLC檢測，HPLC實驗條件同HPLC-IT-TOF MS中的液相色譜條件。

圖1 蘇丹紅Ⅱ純品中主成分和 雜質分離的色譜圖Fig.1 Chromatogram of main component and impurities in Sudan Ⅱ

2 結果與討論

2.1 蘇丹紅Ⅱ純品中有機雜質的定性

通過選擇合適的色譜柱對液相色譜流動相的組成、流速等條件進行優(yōu)化，得到了分離蘇丹紅Ⅱ及雜質的最佳實驗條件，見1.3.1節(jié)。蘇丹紅Ⅱ主成分及其雜質成分的色譜圖和總離子流圖分別示于圖1和圖2。

注：為了防止高濃度的主成分蘇丹紅Ⅱ進入 質譜儀而造成污染，且已無其他雜質出現(xiàn)， 32.5 min后管路自動切至廢液中，不進入質譜儀掃描 圖2 蘇丹紅Ⅱ純品中雜質分離的總離子流圖Fig.2 TIC of impurities in Sudan Ⅱ

分析圖1中色譜歸一化結果，只有雜質2的含量大于千分之一。通過HPLC-IT-TOF MS獲得的蘇丹紅Ⅱ和4種雜質的母離子、子離子的精確分子質量列于表1。由于雜質含量較低，通過HPLC-IT-TOF MS獲得的子離子數(shù)目較少，因此，采用HPLC-MS/MS法對蘇丹紅Ⅱ及其4種雜質進行二級質譜裂解，結果示于圖3和圖4。通過質譜裂解途徑解析，預測未知雜質的分子式，并采用相應雜質的純品進行驗證。

表1 蘇丹紅Ⅱ及其雜質的母離子和子離子參數(shù)Table 1 Parent ions and product ions of Sudan Ⅱ and the impurities

圖3 蘇丹紅Ⅱ的碎片離子峰及質譜裂解途徑Fig.3 Fragment ions and fragmentation pathways of Sudan Ⅱ

圖4 雜質1(a)、2(b)、3(c)、4(d)的碎片離子峰Fig.4 Fragment ions of impurities 1 (a), 2 (b), 3 (c), 4 (d)

由圖3和圖4可知，雜質1、2和蘇丹紅Ⅱ均有m/z156碎片峰，因此可通過蘇丹紅Ⅱ的已知結構對雜質1和2的結構式進行推導。雜質1的分子離子峰[M+H]+為m/z249，比蘇丹紅Ⅱ的分子離子峰[M+H]+m/z277少28(即2個—CH2)，雜質1的可能結構式示于圖5a，可能的質譜裂解途徑示于圖6a。雜質2的分子離子峰m/z263，與蘇丹紅Ⅱ的分子離子峰m/z277相差14(—CH2)，結合蘇丹紅Ⅱ的結構式推導出雜質2可能的結構式示于圖5b和5c，根據(jù)這兩種結構式查找相關化合物，發(fā)現(xiàn)b并無CAS號，即可暫認定雜質2的可能結構式為c。推測其可能的質譜裂解途徑示于圖6b。

圖5 雜質1(a)和2(b、c)的可能結構式Fig.5 Possible structures of impurities 1 (a) and 2 (b, c)

圖6 雜質1(a)和2(b)的質譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathways of impurities 1 (a) and 2 (b)

結合文獻[12]、結構式分析和質譜裂解規(guī)律，初步推測雜質1為蘇丹紅Ⅰ，雜質2為溶劑橙2。

采用HPLC-IT-TOF MS法對蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2的純品進行一級、二級碎片分析，得到的精確分子質量和碎片離子質荷比結果列于表2。

表2 蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2的母離子和子離子參數(shù)Table 2 Parent ions and product ions of Sudan Ⅰand Solvent Orange 2

向蘇丹紅Ⅱ樣品中分別加入蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2進行HPLC測試，結果示于圖7?？芍?，雜質1和2的峰高明顯增加，保留時間完全一致，從而可以確定雜質1和雜質2分別為蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2。

通過比較蘇丹紅Ⅱ樣品中雜質及純品的保留時間、分子質量及碎片信息，發(fā)現(xiàn)雜質1與雜質2分別與蘇丹紅Ⅰ、溶劑橙2完全一致。因此，最終確認雜質1為蘇丹紅Ⅰ，雜質2為溶劑橙2。

雜質3和4的準分子離子峰均為m/z277，且裂解方式符合蘇丹紅Ⅱ的碎裂特征，推測是蘇丹紅Ⅱ的同分異構體，即分子式均為C18H16N2O，可能的結構式示于圖8。由于市場上沒有該物質的純品，所以無法對該推測結果進行驗證。

2.2 雜質純品純度定值

雜質蘇丹紅Ⅰ采用一級標準物質GB W10056，純度標準值為99.9%。

溶劑橙2的液相色譜面積歸一法結果列于表3，溶劑橙2的純度為99.13%，6次測量得到的相對標準偏差為0.042%。

圖7 添加蘇丹紅Ⅰ前(a)、后(c)和溶劑橙2前(b)、后(d)的蘇丹紅Ⅱ樣品的色譜圖Fig.7 Chromatograms of Sudan Ⅱ samples before (a, b) and after (c, d) adding Sudan Ⅰ and Solvent Orange 2

圖8 雜質3(a)和4(b)的可能結構式Fig.8 Possible chemical structures of impurities 3 (a) and 4 (b)

樣品 Sample純度 Purity/%199.21299.10399.11499.11599.12699.20平均值99.13相對標準偏差/%0.042

2.3 蘇丹紅Ⅱ純品中主要有機雜質的定量

對雜質1和2定性后，選取相應純品，采用外標工作曲線法對其進行定量測定。由于雜質3和4沒有相應純品，且其是蘇丹紅Ⅱ的同分異構體，所以采用與主成分蘇丹紅Ⅱ響應因子一致的方法對這2種雜質進行定量分析[11, 13]。

蘇丹紅Ⅰ的線性回歸方程為y=81.574x-0.288 6，相關系數(shù)R2=1。溶劑橙2的線性回歸方程為y=83.417x-0.655 4，相關系數(shù)R2=1。6份蘇丹紅Ⅱ樣品中雜質1～4的測量結果列于表4。

表4 蘇丹紅Ⅱ中主要有機雜質的含量測定結果Table 4 Contents of main organic impurities in Sudan Ⅱ

3 結論

本實驗采用HPLC-IT-TOF MS法和LC-MS/MS法對蘇丹紅Ⅱ中的有機雜質進行定性分析，采用HPLC外標法對已定性雜質進行定量分析，得到雜質蘇丹紅Ⅰ和溶劑橙2的含量分別為0.017%、0.258%，相對標準偏差分別為1.6%、2.5%。對未完全定性的雜質3和4采用與主成分蘇丹紅Ⅱ響應因子一致的方法進行定量分析，其含量分別為0.012%、0.028%，相對標準偏差分別為7.0%、4.9%。該實驗可為蘇丹紅Ⅱ一級標準物質的研制奠定基礎，對食品檢驗等領域中蘇丹紅Ⅱ的準確測定具有重要意義。