馮鵬程，王佳玲，李媛媛，張榮露，陶 佩，周 敏，朱靜怡，繆文俊，黃 和

(1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800；2.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

隨著對疾病發(fā)生發(fā)展機制認識的不斷深入和醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤的診斷與治療技術(shù)也在不斷完善和提高。但是惡性腫瘤仍然是全球范圍內(nèi)危害人類健康的重大疾病之一，也是人類疾病致死的第二大原因。據(jù)國家癌癥中心2017年2月發(fā)布的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2013年我國總體癌癥發(fā)病率每10萬人186例，其中因癌癥致死的有109例，而與2012年相比，腫瘤新發(fā)病例仍呈現(xiàn)增長的趨勢，從358萬增加到368萬，增幅達3%[1]。

傳統(tǒng)的腫瘤治療方法有放射性療法、化學(xué)療法和手術(shù)治療等，但這些方法都表現(xiàn)出副作用較大、產(chǎn)生耐受性和腫瘤復(fù)發(fā)的缺點[2]，腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量并未能得到顯著改善。近年來，以靶向治療、免疫治療和細胞治療為代表的新型腫瘤療法方興未艾，但尚未有革命性的突破。因此，亟待開發(fā)有效治療惡性腫瘤的新方案。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒(upconversion nanoparticles，UCNPs)基于近紅外光(NIR)激發(fā)，可以將長波輻射轉(zhuǎn)換為短波輻射，具有降低自發(fā)熒光背景干擾、較高的組織穿透能力以及優(yōu)良的光學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點，因而在腫瘤治療領(lǐng)域備受青睞[3-4]。此外，UCNPs易于功能化修飾、生物毒性低，在很多方面都有應(yīng)用潛能，如生物標記、細胞/活體成像、病變檢測、DNA檢測及生物傳感等。本文中，筆者就UCNPs應(yīng)用于腫瘤診斷和治療的作用機制及研究進展進行系統(tǒng)介紹，同時對UCNPs在毒性檢測和生物傳感等方面的應(yīng)用情況進行簡要概述并指出其未來的研究發(fā)展方向。

1 上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)概述

UCNPs主要由氧化物、氟化物和鹵氧化物等基質(zhì)通過摻雜三價稀土離子構(gòu)成，是一種低毒、穩(wěn)定和發(fā)光壽命長的新型熒光探針[5-6]，其經(jīng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程可將連續(xù)吸收的2個或多個泵浦光子轉(zhuǎn)化成為比泵浦光波長更短的光。通常采用近紅外連續(xù)激光(700～1 100 nm)作為激發(fā)光源,因為它具有較深的組織穿透深度、對生物組織幾乎無損傷及背景熒光干擾低等顯著優(yōu)勢，從而被應(yīng)用于生物成像，包括體外細胞成像、體組織和小動物活體成像以及多模式活體成像等方面[7-9]。

1.1 UCNPs的發(fā)光機制

UCNPs通過吸收兩個或以上的低能光子而輻射出一個高能光子，這種現(xiàn)象稱為上轉(zhuǎn)換發(fā)光(upconversion luminescence,UCL)，即上轉(zhuǎn)換材料在NIR光激發(fā)下可發(fā)出可見光和/或紫外光，它最大的特點是材料所吸收的光子能量低于其發(fā)射出的光子能量，因此被稱為“上轉(zhuǎn)換材料”,這一過程是違背Stokes定律的，因此又被稱為“反Stokes發(fā)光”[10]。UCNPs的發(fā)光機制(圖1)主要分為激發(fā)態(tài)吸收(excited state absorption,ESA)、能量轉(zhuǎn)移(energy transfer upconversion,ETU)和協(xié)同敏化(cooperative sensitization upconversion,CSU)等三類[11]。

圖1 上轉(zhuǎn)換材料的發(fā)光機制[11]Fig.1 Principles of UCL process[11]

1.2 提高上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率的方法

對于UCNPs中摻雜的三價稀土離子，目前研究較多的有Er3+、Eu3+、Yb3+、Tm3+和Ho3+等，它們都具有豐富的能級，同時由于受到4f能級外層電子的屏蔽作用，表現(xiàn)出較高的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率，常作為上轉(zhuǎn)換材料的激活劑[12]。為提高上轉(zhuǎn)換材料的發(fā)光效率，王霞等[13]將小半徑的鋰離子(Li+)分別摻入到α-TeO2:Tm3+/Er3+/Yb3+和β-TeO2:Tm3+/Er3+/Yb3+這兩種稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換材料中，研究發(fā)現(xiàn)，摻入Li+后，前者的發(fā)光強度增強了3倍，后者增強了1倍，說明摻入Li+可以提高上轉(zhuǎn)換的發(fā)光強度；對于不同的UCNPs，摻入Li+后的發(fā)光強度的變化差異性較大，所以在實際應(yīng)用中應(yīng)注意考察Li+摻入量及其發(fā)光強度的具體變化。胡榮璇等[14]通過調(diào)整Gd3+的摻雜量來控制溶劑熱法制備的NaYF4:Yb3+,Tm3+/Er3+，由立方相到六方相的相變以及納米產(chǎn)物的尺寸，可以實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光的有效增強，該研究中摻雜Gd3+取代部分Y3+，但由于兩者的原子半徑不同，在提高材料發(fā)光效率的同時也會改變納米粒子的尺寸大小，因此對反應(yīng)的定量要求較高。

劉珊珊等[15]利用溶劑熱法制備了不同F(xiàn)-濃度條件下的NaYF4:20%Yb3+/2% Er3+上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米晶體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該材料在980 nm連續(xù)激光器激發(fā)下具有較強的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效應(yīng)，F(xiàn)-濃度對納米晶體的粒徑及晶型結(jié)構(gòu)起著關(guān)鍵性作用，隨著F-濃度的增加，UCNPs的成核速度加快，合成的納米晶體粒徑較小且結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，但過高的F-濃度會使其吸附在晶體表面而影響熒光強度。因此，在UCNPs的合成過程中要注意控制F-濃度，以控制納米顆粒的尺寸及結(jié)構(gòu)，從而提高UCNPs的發(fā)光效率。

1.3 UCNPs的可控制備方法

UCNPs的尺寸、晶體結(jié)構(gòu)、形貌和單分散性是影響其UCL性能的重要因素，需要控制其合成條件以達到控制其發(fā)光性能的目的。UCNPs代表性的合成方法有共沉淀法、熱分解法和溶劑熱法等[16]。針對一些具有特殊功能的納米材料，可能需要聯(lián)合多種方法進行制備。

1.3.1 共沉淀法

共沉淀法指的是將原料配制成溶液，加入沉淀劑，使原料中的離子以沉淀的形式析出，對沉淀進行洗滌、干燥及退火等處理后得到所需的納米材料的方法。該方法簡便、條件易達到且成本較低，可用于批量生產(chǎn)UCNPs。但此過程中常因沉淀劑或其他離子局部濃度過高而產(chǎn)生納米顆粒粒徑不均一的現(xiàn)象。因此，可通過加入穩(wěn)定劑，如：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯亞胺(PEI)或乙二胺四乙酸(EDTA)等，使沉淀物發(fā)生配位化合反應(yīng)，可有效控制UCNPs的生長[17]。

1.3.2 熱分解法

熱分解法指的是將前體物溶解在高沸點溶劑中制備單分散的UCNPs的方法。常用的高沸點溶劑有油酸(oleic acid,OA)和十八烯(octadecene,ODE)。北京大學(xué)嚴純?nèi)A院士課題組的Yin等[18]利用N2保護條件將稀土金屬三氟乙酸鹽溶于高沸點溶劑中，升高溫度至250～340 ℃后反應(yīng)6 h，制備一系列高質(zhì)量的基于NaYF4的不同發(fā)光性質(zhì)的UCNPs。盡管能制備出尺寸均勻、形貌可控、單分散性好且發(fā)光性能較高的油溶性UCNPs，但該方法所需要的條件較為苛刻、成本高，且副產(chǎn)物有毒性，不符合綠色合成理念，這在一定程度上限制了其應(yīng)用。

1.3.3 溶劑熱法

溶劑熱法主要是在特殊的密閉體系中，以有機物或非水溶媒為溶劑，在一定的溫度和溶液的自生壓力下進行反應(yīng)的合成方法。該法由清華大學(xué)李亞棟院士課題組的Wang等[19]首次提出后發(fā)展起來，通過在合適的溶劑體系中加入稀土離子溶液及合適的穩(wěn)定劑來控制產(chǎn)物的形貌大小，在攪拌的條件下加入氟化物水溶液并攪拌均勻，通過調(diào)節(jié)溫度、反應(yīng)時間和離子濃度等反應(yīng)條件來控制UCNPs的形貌、尺寸和表面性質(zhì)等。

2 UCNPs用于腫瘤診斷與治療的研究進展

目前，UCNPs在腫瘤診斷與治療的研究主要集中在光動力療法、光熱療法、化學(xué)聯(lián)合療法、多模成像指導(dǎo)的診療一體化及體外診斷等方面。

2.1 光動力療法

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑吸收特定波長的激發(fā)光后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處在激發(fā)態(tài)的電子一部分通過輻射躍遷回基態(tài)發(fā)射熒光，另一部分電子則到達三重態(tài)與周圍環(huán)境中的氧分子發(fā)生能量傳遞，產(chǎn)生有生物毒性的單線態(tài)氧(1O2)等活性氧簇(ROS)，從而達到殺死腫瘤細胞的目的。光動力過程中包括特定波長的光、光敏劑(PS)和細胞及組織中的氧分子等3個基本要素[20]。光動力治療具有選擇性高、副作用小和創(chuàng)傷小等優(yōu)點[21]。目前，PDT已經(jīng)應(yīng)用于皮膚、頭頸部、食管、胰腺和膀胱等淺層及空腔臟器的腫瘤治療中。

在1平方分米表象的建立中，教師引導(dǎo)學(xué)生利用手勢做成大致1平方分米的小正方形，讓學(xué)生帶著這個隨身攜帶的平方分米去尋找生活中的表象；1平方米表象的建立中，引導(dǎo)學(xué)生在一張1平方米的白紙站一站，數(shù)數(shù)能站的人數(shù)。通過實踐、操作、游戲等活動，建構(gòu)面積單位的模型。

UCNPs與光敏劑的結(jié)合能有效改善光敏劑體內(nèi)遞送困難、靶向性低等問題[22-23]，具有良好的應(yīng)用前景。UCNPs作為PDT的最佳理論材料，其NIR激發(fā)光具有更深的組織穿透能力，并且其發(fā)射的紫外光或者可見光可用于活化光敏劑，產(chǎn)生具有高度反應(yīng)性的ROS，從而達到直接殺死癌細胞或摧毀腫瘤部位血管及激活宿主免疫系統(tǒng)等目的[24]。

2.1.1 UCNPs提高PDT的治療深度

NIR光很少被水或血紅蛋白等生物大分子吸收，具有較好的生物組織穿透能力。UCNPs在PDT中起到類似于光轉(zhuǎn)換器的作用，能將吸收的近紅外光轉(zhuǎn)換為激活光敏劑的可見光或紫外光，從而增加PDT治療深度。Wang 等[25]將酞菁鋅(ZnPc)以靜電吸附作用結(jié)合到LiYF4:Yb/Er UCNPs上，用于小鼠腫瘤的PDT，研究發(fā)現(xiàn)，治療2周后，實驗組的小鼠腫瘤體積相對于對照組明顯減小。該研究證實了UCNPs應(yīng)用于抗腫瘤治療時能夠增強PDT效果。Tian等[26]將3種常用的光敏劑二氫卟酚e6(Ce6)、酞菁鋅(ZnPc)和亞甲藍(MB)加載到α-環(huán)糊精修飾的NaYF4:Yb/Er UCNPs上形成Ps@UCNPs復(fù)合物，結(jié)果表明：在980 nm NIR光激發(fā)下，Ps@UCNPs復(fù)合物能有效產(chǎn)生1O2以殺死腫瘤細胞。Hou等[27]設(shè)計了一種基于TiO2殼包裹的具有核殼結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料(UCNPs@TiO2NCs)，利用NaYF4:Yb3+,Tm3+@NaGdF4:Yb3+在NIR光激發(fā)下發(fā)射被TiO2吸收的紫外光，胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，降低線粒體的膜電位，釋放出細胞色素C，從而激活Caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡(圖2)，研究發(fā)現(xiàn)：UCNPs@TiO2作為光敏劑，經(jīng)NIR光激發(fā)，可以更有效地抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長。

圖2 基于上轉(zhuǎn)換納米復(fù)合材料的PDT誘導(dǎo) 細胞凋亡的分子機制[27]Fig.2 Molecular mechanism of induced apoptosis with upconversion nanocomplex mediated PDT treatment[27]

2.1.2 UCNPs提高PDT的腫瘤靶向性

UCNPs本身由于具有較強的實體瘤高通透性及滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,EPR)，能夠很好地被動靶向至腫瘤部位，通過進一步的表面修飾，可以提高其在腫瘤部位的特異性蓄積，從而提高療效并減少對正常組織產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

腫瘤細胞表面高表達葉酸(folic acid,FA)受體[28]，因此，葉酸分子可用于腫瘤細胞的靶向配體。Liu等[29]報道了用FA修飾的NaYF4:Yb3+,Er3+-RB的上轉(zhuǎn)換納米復(fù)合物能夠提高對腫瘤細胞的靶向性，進而提高其參與的成像指導(dǎo)下的抗腫瘤療效。Hou等[30]構(gòu)建了紫外光-藍光雙重光敏劑上轉(zhuǎn)換納米平臺，即多殼晶體材料NaYF4:Yb/Tm@NaYF4:Yb@NaNdF4:Yb NaYF4(UCNPs)與紫外光激發(fā)光敏劑二氧化鈦(TiO2)及藍光激發(fā)光敏劑竹紅菌甲素(HA)，該材料在外層修飾透明質(zhì)酸(Hyal)來提高腫瘤靶向性，經(jīng)808 nm光激發(fā)實現(xiàn)腫瘤的PDT。該研究表明，雙光敏劑納米平臺通過有效的腫瘤靶向分子表現(xiàn)出增強的抗腫瘤效果，這對開發(fā)下一代NIR介導(dǎo)的PDT有著指導(dǎo)性意義。

2.1.3 以UCNPs為平臺的聯(lián)合治療

近幾年來，一些研究者致力于將多種治療方式整合到UCNPs平臺上，以實現(xiàn)協(xié)同增強的抗腫瘤效果。Liu等[31]構(gòu)建了一個以UCNPs為核心、光敏共軛聚合物和轉(zhuǎn)鐵蛋白-二茂鈦(Tf@Tc)為殼的多層次雙光敏劑上轉(zhuǎn)換納米粒子UCNPs@PFSBT@Tf@Tc。在NIR照射下，UCNPs核產(chǎn)生的表觀能量轉(zhuǎn)移到光敏共軛聚合物和轉(zhuǎn)鐵蛋白-二茂鈦構(gòu)成的殼層中，利用該過程產(chǎn)生的ROS殺死癌細胞。研究發(fā)現(xiàn)，給予UCNPs@PFSBT@Tf@Tc納米粒子的荷瘤小鼠，經(jīng)NIR照射后，腫瘤生長被顯著抑制，腫瘤體積在治療的第14天下降到35%。

Zhao等[32]合成了新型Caspase-3響應(yīng)性功能化的上轉(zhuǎn)換納米粒子(Caspase-3 responsive functionalized upconversion nanoparticles,CFUNs)，實現(xiàn)了三重抗腫瘤效果的整合：近紅外光觸發(fā)的光動力學(xué)治療/Caspase-3酶的活化以及Caspase-3酶響應(yīng)性藥物的釋放和級聯(lián)化療作用的激活，CFUNs在體內(nèi)外都表現(xiàn)出協(xié)同抗腫瘤效果，并且在黑暗條件下，其不產(chǎn)生治療效果且細胞毒性極小。NIR激活的級聯(lián)腫瘤治療方法有兩種不同的機制，這有利于克服腫瘤治療過程中遇到的多藥耐藥性和腫瘤異質(zhì)性問題。

Chen等[33]合成了一種新型核-殼-殼納米材料(圖3)，由上轉(zhuǎn)換核心NaYF4:Yb,Tm@NaYF4和竹紅菌甲素(HA)/碳量子點吸附在介孔SiO2表面形成夾層殼結(jié)構(gòu)，介孔SiO2作為外殼形成的納米結(jié)構(gòu)，通過將抗癌藥物鹽酸阿霉素包封在介孔SiO2中，并設(shè)計了光敏性鄰硝基芐基衍生物接頭(NB)作為“門”控制藥物的釋放，在980 nm光照射下，UCNPs轉(zhuǎn)換發(fā)射的紫外光能夠引起NB連接體和藥物之間的化學(xué)鍵斷裂，從而釋放化療藥物，同時發(fā)射的可見光激發(fā)HA產(chǎn)生單線態(tài)氧，攝入的碳量子點也能通過吸收UCNPs發(fā)射出來的光釋放熱量。結(jié)果證明：該材料能夠整合成像治療、PDT、光熱療法(photothermal therapy,PTT)及化學(xué)療法實現(xiàn)協(xié)同增強抗腫瘤效果，UCNPs與碳量子點、竹紅菌甲素(HA)相結(jié)合的納米復(fù)合材料將成為成像引導(dǎo)的抗腫瘤療法的潛在候選者。

圖3 LA-UCNPs@SiO2-C/HA@mSiO2-DOX@NB 納米復(fù)合材料的制備及其聯(lián)合抗腫瘤治療作用 機制[33]Fig.3 Preparation and multiple-therapy mechanism of LA-UCNPs@SiO2-C /HA@mSiO2-DOX@NB nanocomposites[33]

2.2 光熱療法

PTT是一種新型腫瘤治療方法，利用具備較高光熱轉(zhuǎn)換效率的材料作為光熱劑，在NIR光照射下吸收光能并轉(zhuǎn)化為熱能，可以對腫瘤細胞或組織進行選擇性地局部加熱，從而殺死癌細胞。PTT的有效性主要取決于光熱劑的光熱轉(zhuǎn)換效率。常用的光熱劑為具有優(yōu)良的等離子體共振吸收效應(yīng)的貴金屬納米材料，如金、銀納米顆粒。應(yīng)用于光熱療法的理想金屬納米材料應(yīng)該具有強且可調(diào)的表面等離子共振吸收效應(yīng)、易傳輸、毒性低以及容易與腫瘤細胞結(jié)合等優(yōu)點[34]；具有固定近紅外吸收帶的CuS[35]、Cu9S5[36]和LaB6[37]納米粒子也是一類新型光熱劑，用于PTT。Qian等[38]合成了NaYF4:Yb,Er@NaYF4@SiO2@Au納米顆粒(70～80 nm)，金納米顆粒(～6 nm)沉積在SiO2表面，有效提高了光熱轉(zhuǎn)換效率。實驗發(fā)現(xiàn)，該納米材料能有效地破壞人神經(jīng)母細胞瘤細胞，具有很好的抗腫瘤療效。

2.3 化學(xué)聯(lián)合療法

為了實現(xiàn)可激活的光敏劑-化學(xué)藥物的聯(lián)合治療，Hu等[41]首次設(shè)計了由可激活光敏劑和化療前藥構(gòu)建的雙重前藥，利用UCNPs載入具有較低的全身毒性的化學(xué)前體藥物絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)，開發(fā)了一個智能治療平臺來實現(xiàn)藥物在病灶部位的精準治療。MMC是一種含有醌結(jié)構(gòu)的廣譜DNA交聯(lián)抗癌藥物，可作為光致電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)熒光淬滅劑[42]。通過二硫鍵連接MMC與光敏劑乙烯基吡啶鎓取代的四苯基乙烯TPEPY，形成光敏劑和化學(xué)前藥的雙前體藥物TPEPY-S-MMC。其中，TPEPY在聚集狀態(tài)下能夠產(chǎn)生強熒光并生成大量ROS[43]；而化學(xué)前體藥物MMC具有醌結(jié)構(gòu)，作為單線態(tài)氧淬滅劑，可以阻斷光敏劑(TPEPY-SH)的光敏活性，即TPEPY-S-MMC不發(fā)出熒光也不能產(chǎn)生ROS。同時，MMC的氮原子處的吸電子?；軌蚪档蚑PEPY-S-MMC的系統(tǒng)毒性，當藥物與谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)后，TPEPY-S-MMC被激活成具有光動力活性的TPEPY-SH和化學(xué)藥物MMC，從而發(fā)揮聯(lián)合抗腫瘤效果。具有智能控制激活過程的PDT和化療平臺組合并不多見，集成可激活的光敏劑和化學(xué)-前藥的組合療法是非常有意義的，可激活的光敏劑還能適當降低藥物的副作用，提供更有利的治療效果。

2.4 多模成像指導(dǎo)的診療一體化式納米平臺

多功能納米平臺通常是將生物傳感、成像診斷，如計算機斷層掃描(computer tomography，CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、超聲成像(ultrasound imaging，UI)、熒光成像(fluorescence imaging，F(xiàn)I)和治療功能，如PDT、PTT及化學(xué)療法等集成到單一的納米結(jié)構(gòu)中。由于納米科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，這樣的整合體系可以達到更高的診斷要求和更優(yōu)異的腫瘤治療效果，已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注。Liu等[44]構(gòu)建了一種結(jié)合UCL成像、MRI成像、CT成像、PTT及化學(xué)療法五大功能的多模態(tài)納米探針UCNPs@PDA5-PEG-DOX，該方法將聚多巴胺(PDA)殼涂布在β-NaGdF4:Yb3+,Er3+@β-NaGdF4上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)核上形成核殼結(jié)構(gòu)的納米載體，通過聚乙二醇修飾后，載入藥物鹽酸阿霉素(DOX)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該材料的毒性低，抗腫瘤活性強，在808 nm NIR激光照射下，該納米藥物能夠完全根除患結(jié)腸癌小鼠體內(nèi)腫瘤。此外，通過溶血試驗、組織學(xué)分析以及血液分析等研究發(fā)現(xiàn)該載體具有可以忽略的毒性。

為了提高藥物抗腫瘤效果，通常將UCNPs與其他具有特定功能的材料通過化學(xué)或物理方式相結(jié)合，實現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤作用。Feng等[45]開發(fā)了一種多功能納米系統(tǒng)，即合成的UCNPs@ZrO2-Ce6/DOX/PCM納米系統(tǒng)(圖4)，通過將化療藥物鹽酸阿霉素和光敏劑Ce6加載到涂覆有中空介孔二氧化鋯(ZrO2)的Nd3+摻雜的UCNPs中，并在NIR光照射下溫度升高，利用溫敏相變材料(phase change material,PCM)十四烷醇作為控制釋放阿霉素和ROS的開關(guān)。該材料通過靜脈注射給荷瘤小鼠，在溫和的NIR激光照射下(0.5 W/cm2,5 min)表現(xiàn)出優(yōu)異的體內(nèi)協(xié)同抗腫瘤效果，提示UCNPs@ZrO2-Ce6/DOX/PCM可以作為理想的納米平臺，用于多模成像引導(dǎo)的腫瘤治療。

圖4 在808 nm激光照射下UCNPs@ZrO2-Ce6/ DOX/PCM的聯(lián)合抗腫瘤示意圖[45]Fig.4 Schematic illustration of combined cancer therapy under mild 808 nm laser irradiation of UCNPs@ZrO2-Ce6/DOX/PCM multifunctional nanotheranostics[45]

Cen等[46]開發(fā)了聚多巴胺(PDA)修飾的核殼型多功能上轉(zhuǎn)換納米平臺，用于腫瘤細胞內(nèi)相關(guān)mRNA的檢測，同時結(jié)合NIR光觸發(fā)的PDT及PTT協(xié)同療法，增強抗腫瘤效果。先合成油酸修飾的疏水性UCNPs(OA-capped NaYF4:Yb,Er,Tm,OA-UCNPs)，通過表面接枝SiO2殼載入親水性光敏劑亞甲藍(MB)中，多巴胺(DA)通過氧化自我聚合，在多種底物表面形成聚多巴胺(PDA)殼，形成核殼納米結(jié)構(gòu)UCNPs@SiO2-MB@PDA(圖5)。PDA與單鏈DNA的結(jié)合能力強于雙鏈DNA，并且由于自身具有優(yōu)異的熒光淬滅性能，通過在PDA上吸附熒光標記的hairpin DNA(hpDNA)形成UCNPs@SiO2-MB@PDA-hpDNA發(fā)夾型納米探針用于監(jiān)測細胞內(nèi)腫瘤相關(guān)mRNA，可以區(qū)分正常細胞和癌細胞。在655 nm光激發(fā)下，UCNPs發(fā)射的上轉(zhuǎn)換熒光被光敏劑MB分子吸收，可用于PDT；在800 nm光激發(fā)下，由于PDA具有強NIR光吸收效率及高的光熱轉(zhuǎn)換效率，UCNPs發(fā)射的上轉(zhuǎn)換熒光能夠被PDA吸收，可用于PTT。該體系用于人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞HeLa和人肝癌細胞HepG2時，在無激光照射條件下，細胞的存活率均接近100%；而當激光照射時，細胞的存活率明顯降低，其中MCF-7的存活率最低降至僅12%，這些表明所開發(fā)的多功能納米平臺在未來的腫瘤治療領(lǐng)域具有可觀的開發(fā)前景。

圖5 UCNPs@SiO2-MB@PDA多功能納米平臺的 構(gòu)建及其作用機制[46]Fig.5 The construction and mechanism of UCNPs@ SiO2-MB@PDA multifunctional nanoplatform[46]

2.5 UCNPs在腫瘤的體外診斷方面的應(yīng)用及研究進展

腫瘤的診斷分為體內(nèi)和體外診斷兩方面，其中，體外診斷又可分為兩類，一類是對腫瘤組織的病理檢查，另一類是通過采集體液樣本進行的液態(tài)活檢。組織病理檢查對腫瘤的篩查、分期及位置的確定有著極其重要的作用。此外，腫瘤液態(tài)活檢技術(shù)也發(fā)展迅猛，該技術(shù)只需要檢測血液樣本，其便利性將推動新型血液診斷的快速發(fā)展[47-48]。

UCNPs由于具有優(yōu)異的熒光性能，在腫瘤體外診斷方面的研究也受到了廣泛關(guān)注，很多基于UCNPs的體外診斷試劑盒已被開發(fā)。華東等[49]發(fā)明了一種利用抗體功能化磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換熒光納米材料及抗原-抗體反應(yīng)對癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)進行檢測的試劑盒。該研究將兩種納米材料與抗原-抗體特異性反應(yīng)原理相結(jié)合，建立了一種高度靈敏、穩(wěn)定且快速的CEA檢測方法，利用抗-CEA第一抗體(捕獲抗體)功能化的磁性納米材料對血液樣本中的CEA進行富集并分離；同時利用UCNPs熒光的高靈敏度和有效避免樣本生物背景熒光干擾的特點，用抗-CEA第二抗體(檢測抗體)標記UCNPs(NaY78%F4:Yb 20%,Ho 2%)作為最終檢測探針。目前該試劑盒已在臨床及科研中用于檢測CEA的含量、腫瘤的輔助診斷、指導(dǎo)治療及提示預(yù)后等。

除了特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)方面的應(yīng)用，基于稀土納米熒光探針的腫瘤標志物超靈敏體外檢測方面的研究也引起了廣泛的關(guān)注。有研究表明，腫瘤患者的血液及其他體液中的循環(huán)腫瘤基因(circulating tumor DNA，ctDNA)是一種非常有潛力的腫瘤生物標志物，可用于實時跟蹤腫瘤的發(fā)展以及腫瘤治療的監(jiān)控[50]。在臨床應(yīng)用中，可通過采集ctDNA信息，來評估抗腫瘤藥物的選用、療效以及預(yù)后，甚至可用于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷。然而，在腫瘤患者的外周血中，循環(huán)腫瘤細胞的密度極低，大約平均 106個細胞中僅有一個循環(huán)腫瘤細胞。由于ctDNA含量低(<1.0%)、片段短以及半衰期短(<2 h)，檢測十分困難，而且二代測序背景噪聲很高，用常規(guī)建庫測序方法會使腫瘤信號完全淹沒在背景噪聲中，這些都對核酸提取純化技術(shù)提出了全新的挑戰(zhàn)。因此，針對循環(huán)腫瘤細胞的高效捕獲和檢測的方法在腫瘤早期診斷和預(yù)后評估中起著極為重要的作用。

Shuai等[51]首次提出將UCNPs結(jié)合核酸適配體(aptamer)作為納米探針來識別循環(huán)腫瘤細胞，并利用磁性納米材料富集循環(huán)腫瘤細胞。在該探針中，UCNPs 結(jié)合生物素以及特異性識別靶細胞蛋白酪氨酸激酶PTK-7 的核酸適配體形成Biotin-UCNPs-Aptamer復(fù)合物，可特異性識別靶細胞人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞(CCRF-CEM)。另一方面，用修飾了親和素的磁性納米材料來分離靶細胞，便于對靶細胞進行進一步分析。該納米探針利用UCNPs 無自發(fā)性熒光的特性以及磁性納米材料對靶細胞的有效分離功能，避免了檢測過程中背景熒光信號的干擾，也大大降低了檢測分離中的非特異性吸附，實現(xiàn)了檢測的高靈敏度和高捕獲率，有望用于臨床上采集ctDNA信息。

3 UCNPs的其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

3.1 UCNPs作為免疫熒光探針

UCNPs除了在抗腫瘤方面具有廣泛的應(yīng)用前景，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的其他方面也有著較多的研究。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理設(shè)計成納米探針可用于DNA、RNA 及其他生物分子的免疫分析，朱瑾等[52]制備了一種用于快速測定血清中降鈣素原(procalcitionin，PCT)的免疫層析試紙條，基于功能化修飾后的UCNPs作為熒光標記物。PCT的線性范圍為0.05～50 μg/L，檢測限為0.020 μg/L。應(yīng)用制得的免疫層析試紙條測定血清樣品中的PCT結(jié)果與羅氏電化學(xué)發(fā)光法所測結(jié)果一致，表明該檢測探針具有好的靈敏度及檢測限。

3.2 UCNPs用于藥物體內(nèi)毒性檢測

圖6 發(fā)色團組裝的UCNPs的合理設(shè)計用于 活體檢測亞硝基化肝毒性[53]Fig.6 Rational design of chromophore-assembled UCNPs for the detection of nitrosative hepatotoxicity in vivo[53]

藥物毒性是藥物研發(fā)領(lǐng)域中重點關(guān)注的問題，常規(guī)的血液檢查不能提供實時可視化的毒性監(jiān)測結(jié)果。Peng等[53]利用UCNPs的發(fā)光性來評估體內(nèi)急性肝毒性(圖6)。體內(nèi)注射該納米探針后，它們會聚集在肝臟部位，納米顆粒的發(fā)光性會由于能量轉(zhuǎn)移到發(fā)色團上而受到抑制。但若出現(xiàn)肝毒性，肝臟中會產(chǎn)生大量的過氧化亞硝酸陰離子(ONOO-)，它可以通過與多種生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等結(jié)合導(dǎo)致細胞迅速死亡，常被作為肝毒性的直接指標。ONOO-能夠漂白發(fā)色團使納米顆?；謴?fù)熒光。該材料可利用NIR光的高穿透能力實現(xiàn)對活體動物肝毒性的可視化實時監(jiān)測，與現(xiàn)階段臨床前常用的肝毒性篩查方法，即與檢測表征肝損傷的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的酶含量相比，該方法為評估研發(fā)藥物的肝毒性提供了便利的篩選策略。但ONOO-的半衰期過短，在血漿中的檢測難度大，通過在UCNPs探針表面涂覆聚乙烯亞胺(PEI)和花菁素(Cy7)制備Cy7-PEI-UCNPs納米探針材料，可以增強檢測靈敏度[54]。

3.3 UCNPs用于生物傳感器

劉映等[55]設(shè)計了一個基于上轉(zhuǎn)換熒光猝滅的新型pH傳感器。UCNPs (NaGdF4:Yb3+/Tm3+)在980 nm光激發(fā)下，在475 nm處有較強的發(fā)射峰,可與異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，并且對FITC熒光的淬滅程度取決于環(huán)境的pH。研究發(fā)現(xiàn)，該傳感器在pH 3～5時的響應(yīng)敏感度較高，與熒光背景易受到干擾的傳統(tǒng)方法相比，該新型傳感器具有簡單、快速、靈敏的優(yōu)點和較強的抗干擾能力。除此之外，其生物相容性好、綠色環(huán)保，順應(yīng)現(xiàn)代綠色化學(xué)的發(fā)展要求，為UCNPs在生物分析領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路。

4 結(jié)語

腫瘤的有效治療仍為當今醫(yī)藥領(lǐng)域亟待解決的難題，而傳統(tǒng)的治療方法已經(jīng)不能滿足腫瘤患者生理心理需求。隨著材料科學(xué)、納米科學(xué)技術(shù)和生物醫(yī)藥學(xué)的快速發(fā)展，腫瘤的新型治療手段也越來越先進。近年來，基于稀土元素上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的研究越來越深入，發(fā)現(xiàn)該材料具有獨特的光學(xué)特性、理化性質(zhì)及優(yōu)良的生物相容性等特點，為其開發(fā)成為新型抗腫瘤藥物載體奠定了良好的基礎(chǔ)。

盡管現(xiàn)階段UCNPs在腫瘤的診療方面應(yīng)用研究進展很快，但是UCNPs仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。一方面，目前UCNPs所使用的激發(fā)波長主要是980 nm,這一波長范圍的光會被水吸收產(chǎn)生較強的熱效應(yīng)，從而對正常組織細胞產(chǎn)生危害。因此，在提高PDT效率的同時，如何減少對機體正常組織的損害成為目前的研究熱點。一些研究致力于改變激發(fā)波長以降低熱效應(yīng)并加深穿透深度。Wang 等[56]使用Nd3+構(gòu)建的UCNPs能被808 nm的近紅外光激發(fā)，實現(xiàn)更好的PDT效率。當然，UCNPs除了在腫瘤治療領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展前景，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域其他方面的發(fā)展也是非常樂觀的，如生物樣品檢測、生物成像以及其他疾病的診療一體化平臺的構(gòu)建。

另一方面，現(xiàn)階段UCNPs的研究還僅僅停留在基礎(chǔ)研究階段，并沒有相關(guān)的臨床應(yīng)用。UCNPs若要應(yīng)用于臨床，需要對其毒性進一步研究確證。盡管很多研究聲稱UCNPs在短期應(yīng)用下并不會對機體造成較大的毒性影響，但其長期毒性和慢性毒性仍有待進一步研究。此外，對于如何合理構(gòu)建UCNPs來實現(xiàn)疾病的診療一體化是另一研究熱點，即在將來的UCNPs的研究中，主要的研究方向?qū)侨绾瓮ㄟ^UCNPs載體來構(gòu)建綜合實現(xiàn)腫瘤的診斷、成像、靶向治療及藥物的精準釋放等的一體化平臺。

此外，隨著UCNPs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的日益廣泛，如何采用更加簡便綠色的方法合成出小尺寸、高轉(zhuǎn)換效率的水溶性UCNPs,如何對其表面進行功能化修飾以實現(xiàn)更好的生物相容性及更多領(lǐng)域的應(yīng)用將成為研究重點。同時，納米材料的尺寸、結(jié)構(gòu)都會影響其在生物體內(nèi)的行為，包括分布代謝情況、納米生物效應(yīng)、急性毒性和長期毒性等，因此，需要系統(tǒng)地研究UCNPs的性質(zhì)及其生物學(xué)行為之間的關(guān)系。