楊明明,汪焰恩,魏生民,魏慶華,柴衛(wèi)紅,李欣培

(西北工業(yè)大學(xué)機(jī)電學(xué)院，陜西西安710072)

由于成分組成及物理特性與自然骨中的無(wú)機(jī)礦物鹽很接近，磷酸鈣基生物陶瓷廣泛應(yīng)用于骨組織工程[1]。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是骨組織的主要無(wú)機(jī)礦物鹽，占整個(gè)干骨質(zhì)量的 60%～70%，并且具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，但是純HA支架存在易脆、降解速度慢等缺點(diǎn)；磷酸三鈣(β-TCP)具有良好的生物降解性和生物相容性，植入體內(nèi)能逐漸降解,并被新生骨取代，但是β-TCP在生理環(huán)境下降解速度過(guò)快，力學(xué)強(qiáng)度低。當(dāng)前生物骨材料研究的熱點(diǎn)是通過(guò)多種磷酸鈣基材料混合制備性能優(yōu)良的復(fù)合支架材料，以克服單相生物骨材料缺陷。雙相鈣磷酸鹽(biphasic calcium phosphate， BCP)[2]是由兩個(gè)或更多的陶瓷相復(fù)合而成，可以克服單相陶瓷的缺點(diǎn)。

隨著骨組織工程的發(fā)展，出現(xiàn)了基于計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和制造的快速成型技術(shù)(rapid prototyping，RP)。利用快速成型技術(shù)[3]制備組織工程支架，可克服傳統(tǒng)方法制備人工骨支架尺寸精度不高、力學(xué)強(qiáng)度不佳、無(wú)法實(shí)現(xiàn)個(gè)性化定制骨支架和很難制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的骨支架等缺陷。三維打印[4](three dimension printing，3DP)是快速成型技術(shù)的一種，其工作原理是三維打印機(jī)讀取零件三維截面信息數(shù)據(jù)，通過(guò)控制噴嘴，噴灑黏結(jié)劑，選擇性地將生物骨材料黏在一起形成截面輪廓，層層遞進(jìn)，最后得到零件整體。而在粉末黏結(jié)三維打印骨支架的制備過(guò)程中，黏結(jié)劑對(duì)支架的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能、尺寸精度和生物相容性起到關(guān)鍵的作用，因此，在粉末黏結(jié)三維打印骨支架的制備過(guò)程中，黏結(jié)劑的合理選取顯得尤為關(guān)鍵。

近年來(lái)，各種HA/β-TCP復(fù)合比例已經(jīng)被研究，但是很少應(yīng)用于臨床[1]，最佳的HA/β-TCP復(fù)合比值也還沒(méi)有確定。Hench等[5]認(rèn)為：對(duì)3D打印的酸性膠水溶液進(jìn)行優(yōu)化可以改善骨支架的打印精度、力學(xué)強(qiáng)度和生物相容性。很少有人研究黏結(jié)劑-粉末系統(tǒng)。因此，新的黏結(jié)劑-粉末系統(tǒng)對(duì)于骨組織工程是非常關(guān)鍵的，這種黏結(jié)劑-粉末系統(tǒng)使得打印的骨支架具有良好的力學(xué)性能和生物相容性。

本研究中，筆者通過(guò)使用不同膠水(聚乙烯醇(PVA)和磷酸)制備具有不同HA/β-TCP比例的復(fù)合骨支架，并對(duì)骨支架的孔隙率、吸水性、力學(xué)性能、微觀結(jié)構(gòu)以及生物相容性等基本性質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究和探討，以期為三維粉末打印骨生物陶瓷支架基體材料和膠水的優(yōu)化、配比選擇提供工藝指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

生物材料HA和β-TCP，購(gòu)于西安博恩生物科技有限公司。HA 和β-TCP粉末的Ca/P化學(xué)組成比分別是1.67和1.5。稱量合適的HA和β-TCP，完全混合以制備理想的HA/β-TCP質(zhì)量配比(100∶ 0、20∶ 80、40∶ 60和60∶ 40)作為打印機(jī)粉料。此外，配制PVA(分子量為79 156，青島優(yōu)索化學(xué)科技有限公司)溶液和磷酸(85%，天津市百世化工有限公司)溶液作為3D打印機(jī)黏結(jié)劑用于制備骨支架。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PVA黏結(jié)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%、磷酸黏結(jié)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.75%時(shí)，骨支架的力學(xué)性能最佳，故本文中，筆者選用PVA黏結(jié)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，磷酸黏結(jié)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.75%。

1.2 骨支架制備

使用三維建模CAD軟件設(shè)計(jì)大孔骨支架(高為3 mm、直徑為10 mm、孔隙率為70%、大孔直徑為600 μm)，并將其導(dǎo)出*.STL格式輸入到3D打印機(jī)(Zprinter 250,美國(guó)ZCorporation有限公司)，制備設(shè)計(jì)的骨支架模型，打印過(guò)程中鋪粉厚度為0.1 mm，黏結(jié)劑的控制用量為0.3 L/m2。待打印完畢，骨支架放在打印機(jī)中干燥2 h(干燥溫度維持在50 ℃)，然后取出試樣支架，去除未黏結(jié)的粉末，完成骨支架制備。圖 1(a)為用于 ZPrinter 250打印機(jī)的骨支架設(shè)計(jì)模型；圖1(b)為所打印的人工骨支架，其直徑、高度與設(shè)計(jì)尺寸(直徑φ=10.0 mm及高度H=3 mm)基本一致。

使用3D打印機(jī)制備兩組骨支架，根據(jù)使用的黏結(jié)劑命名為聚乙烯醇骨支架和磷酸骨支架。每組骨支架有4種不同HA/β-TCP比例的骨支架被制備。表1對(duì)不同成分的骨支架進(jìn)行了標(biāo)記。

表1 不同成分骨支架的標(biāo)記

1.3 骨支架性能測(cè)試

1.3.1 吸水率

通過(guò)骨支架吸水率實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)親水性。將骨支架置于去離子水中，利用ME203E型微量天平(梅特勒-托利多公司)每隔一段時(shí)間(5、10、30、60、120和240 min)測(cè)量骨支架質(zhì)量，稱質(zhì)量前用濾紙將骨支架表面自有液體吸出。最后根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算骨支架的吸水率(bibulous rate)，吸水率[6]的計(jì)算見式(1)。

(1)

式中：m1為骨支架凈質(zhì)量；m2為骨支架各時(shí)間點(diǎn)所測(cè)量的質(zhì)量。

1.3.2 孔隙率

使用重量分析法測(cè)量骨支架的孔隙率(porosity)，其孔隙率P[7]的計(jì)算見式(2)。

P=(1-ρa(bǔ)/ρt)×100%

(2)

式中：ρa(bǔ)和ρt分別表示骨支架的實(shí)際密度和材料的理論密度，理論密度是指由HA粉體材料及黏結(jié)劑構(gòu)成的密實(shí)結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的密度，經(jīng)測(cè)定，其值為3.08～3.17 g/cm3(HA和β-TCP的理論密度[8]分別為3.156和3.07 g/cm3)，骨支架的實(shí)際密度等于其總質(zhì)量除以總體積。

1.3.3 力學(xué)性能

利用CTM250型力學(xué)電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(上海協(xié)強(qiáng)儀器制造有限公司)對(duì)樣件支架進(jìn)行抗壓測(cè)試。加載時(shí)，壓頭速度2 mm/min，每組測(cè)6個(gè)樣件。

1.3.4 支架微觀特性

本研究使用X-MAX20/INCA 250型掃描電子顯微鏡(SEM，TESCAN公司)分別在100倍、200倍和500倍放大倍率下觀察人工骨支架的微觀形貌。

1.4 細(xì)胞增殖和分化實(shí)驗(yàn)

選出生1個(gè)月的大鼠，麻醉處死，無(wú)菌條件下從脛骨中獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸浮液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、相對(duì)濕度95%的環(huán)境下培養(yǎng)，達(dá)到85%鋪滿，胰酶進(jìn)行消化傳代，1×104個(gè)/cm2的細(xì)胞密度接種，每隔2 d換培養(yǎng)液。第3代細(xì)胞被用于后續(xù)試驗(yàn)。

將8種支架分別置于100%酒精溶液中浸泡24 h處理，然后分組放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)。用完全培養(yǎng)基將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制成細(xì)胞懸液調(diào)整成2×106個(gè)/mL細(xì)胞濃度的懸浮液，并往裝有骨支架的孔內(nèi)分別滴加10 μL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。而后靜置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，3 h 后取出并翻轉(zhuǎn)骨支架，再滴加 10 μL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，并繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3 h。之后向裝有骨支架樣本的培養(yǎng)孔內(nèi)分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%磷酸鹽緩沖液(PBS)的完全培養(yǎng)基，每隔2 d對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行更換。分別于細(xì)胞接種骨支架后3、7和14 d將骨支架取出(每組樣本數(shù)為6)，用無(wú)菌PBS沖洗后重新放置于新24孔板內(nèi)，按照CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，最后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔板內(nèi)，并通過(guò)紫外酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定其吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用方差分析及q檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 HA/β-TCP的比例對(duì)骨支架吸水性的影響

記錄兩組支架不同時(shí)間的質(zhì)量，根據(jù)式(1)計(jì)算兩組支架的吸水率，圖2為兩組支架吸水率-時(shí)間的曲線。由圖2可知：在這兩組支架中，HA/β-TCP的比例對(duì)支架的親水性沒(méi)有明顯影響。磷酸骨支架的平均吸水率為173%，然而聚乙烯醇支架的平均吸水率是248%。顯然，就吸水率而言，聚乙烯醇骨支架的親水性更好，這是由于聚乙烯醇有高的吸水性。

H-聚乙烯醇，P-磷酸圖2 HA/β-TCP比例對(duì)骨支架 吸水率的影響Fig.2 Effects of different HA/β-TCP ratios on bibulous rate of scaffolds (P-polyvinyl alcohol scaffolds, H-phosphoric acid scaffolds)

2.2 HA/β-TCP的比例對(duì)骨支架孔隙率的影響

孔隙率的測(cè)量是為了評(píng)價(jià)骨支架的設(shè)計(jì)孔隙率與實(shí)際孔隙率的差別，這個(gè)信息對(duì)于定制骨支架起到關(guān)鍵作用。圖3為兩組支架孔隙率測(cè)量結(jié)果。由圖3可知：骨支架的實(shí)際孔隙率與設(shè)計(jì)的孔隙不一致。對(duì)于聚乙烯醇骨支架，骨支架的實(shí)際孔隙率明顯低于設(shè)計(jì)孔隙率 (p<0.05)。然而，磷酸骨支架樣件的實(shí)際孔隙率呈現(xiàn)出少于5%的偏差。結(jié)果表明膠水對(duì)孔隙率的打印精度有明顯影響。此外，骨支架的孔隙是由兩部分組成的：一部分是設(shè)計(jì)的孔隙，另一部分是粉體材料堆積時(shí)顆粒之間的微小空隙。無(wú)論是聚乙烯醇骨支架還是磷酸骨支架，樣件的實(shí)際孔隙率都低于設(shè)計(jì)的孔隙率，這可以歸因于支架內(nèi)部沒(méi)黏結(jié)的粉末沒(méi)能充分去除。

虛線為設(shè)計(jì)孔隙率(70%)，*表示聚乙烯醇骨支架孔隙率低于設(shè)計(jì)孔隙率圖3 HA用量對(duì)骨支架孔隙率的影響Fig.3 Effects of HA concentration on the scaffold porosity

2.3 力學(xué)性能分析

經(jīng)抗壓強(qiáng)度測(cè)量，兩組支架的抗壓強(qiáng)度如表2所示。由表2可知，顯然磷酸骨支架抗壓性能明顯優(yōu)于聚乙烯醇骨支架。單位化柱狀圖(圖4)可以更好地表述不同材料配比及黏結(jié)劑選用對(duì)支架結(jié)構(gòu)性能的影響。由圖4可知：對(duì)于磷酸骨支架，其平均抗壓強(qiáng)度σbc度為4.7 MPa，當(dāng)HA與β-TCP的比例為40∶ 60和60∶ 40時(shí)，抗壓強(qiáng)度σbc分別是(4.9±0.20)和(4.84.8±0.23)MPa，而彈性模量E則為75～200 MPa，當(dāng)HA與β-TCP的比例為60∶ 40時(shí)，骨支架彈性模量取得最大值(200 MPa)。聚乙烯醇骨支架的平均抗壓強(qiáng)度則為2.7 MPa，彈性模量為30～60 MPa。此結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)腍A與β-TCP復(fù)合比例可明顯提高骨支架的力學(xué)特性。

表2 骨支架的力學(xué)特性

Rouvillain等[9]認(rèn)為TCP對(duì)支架強(qiáng)度起關(guān)鍵作用，骨支架力學(xué)強(qiáng)度隨著β-TCP含量增加而降低。然而，本研究結(jié)果表明，骨支架的強(qiáng)度和β-TCP含量不存在簡(jiǎn)單的單調(diào)關(guān)系，制造方法等其他因素對(duì)支架的強(qiáng)度的影響不可忽略。

不同黏結(jié)劑的使用對(duì)骨支架力學(xué)強(qiáng)度有著很大影響。顯然，筆者所研究的2組骨支架力學(xué)性能有很大差別。由于聚乙烯醇的黏度遠(yuǎn)大于磷酸，降低了聚乙烯醇的流動(dòng)性及浸潤(rùn)特性，進(jìn)而影響了其黏結(jié)生物陶瓷粉末的強(qiáng)度。

人們普遍認(rèn)為，人工骨支架應(yīng)該具有與自然骨相似的力學(xué)特性。松質(zhì)骨的抗壓強(qiáng)度是2 ～12 MPa[10]，因此磷酸骨支架的力學(xué)特性更接近于松質(zhì)骨。

圖4 骨支架力學(xué)性能單位化柱狀圖Fig.4 Normalized bar graph of scaffolds mechanical properties

2.4 骨支架微觀結(jié)構(gòu)

通過(guò)不同放大倍數(shù)的掃描電鏡探究人工骨支架的微觀形態(tài)，可以看出3D打印磷酸人工骨支架的支架內(nèi)部富含多孔結(jié)構(gòu)，骨支架的SEM照片如圖5所示。由圖5可知：由HA和β-TCP均勻混合黏結(jié)成的人工骨支架，其實(shí)際大孔尺寸與設(shè)計(jì)的大孔尺寸非常接近(圖5(a))。由圖5(b)及圖5(c)可以看出：所打印骨支架上遍布HA和β-TCP顆粒形成的2～30 μm微孔。由圖5(d)可以看出：聚乙烯醇骨支架微觀形態(tài)與磷酸骨支架的形態(tài)非常相似，但聚乙烯醇骨支架的實(shí)際大孔尺寸略小于設(shè)計(jì)尺寸，這主要是由于聚乙烯醇具較大的黏度影響了流動(dòng)性，造成了內(nèi)部部分顆粒未能黏結(jié)牢固，坍塌或堵塞了部分內(nèi)部孔道。另外，從圖5(e)、圖5(f)可以觀察到聚乙烯醇骨支架上同樣布滿2～30 μm的微孔，與磷酸骨支架內(nèi)部的微孔差異很小，這說(shuō)明支架內(nèi)部微孔形成于粉末與粉末之間，主要由粉末原材料尺寸決定。由于本文打印磷酸骨支架和聚乙烯醇骨支架所用粉末材料相同(均為HA和β-TCP)，故兩組骨支架內(nèi)部微孔結(jié)構(gòu)尺寸非常相似。圖5結(jié)果表明，使用2種不同黏結(jié)劑制備的骨支架表面形態(tài)相似，均具有粗燥的外表面和實(shí)驗(yàn)表面，這種不規(guī)則微觀表面有利于細(xì)胞黏附[11]。聚乙烯醇骨支架內(nèi)部的設(shè)計(jì)大孔出現(xiàn)了堵塞現(xiàn)象。同時(shí)，2種骨支架內(nèi)部均布滿2～30 μm由HA、β-TCP顆粒材料堆積形成的微孔，這種隨機(jī)微孔構(gòu)成了次級(jí)連通孔隙網(wǎng)絡(luò)，這些次級(jí)微孔連同設(shè)計(jì)大尺寸孔隙網(wǎng)絡(luò)可有效完成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞向支架內(nèi)部的攀爬及維持內(nèi)部細(xì)胞的新陳代謝。大量實(shí)驗(yàn)表明，用于輸送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)到支架內(nèi)部的的連通孔隙網(wǎng)絡(luò)是維持和促進(jìn)支架內(nèi)骨細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素[12-13]。

(a)和(d)分別是磷酸骨支架放大100倍和200倍的SEM；(b)和(e)分別為聚乙烯醇骨支架放大100倍和200倍SEM；(d)和(f)中分別是圖(b)和(e)中紅色矩形區(qū)域500倍SEM；此外，圖中黃圈內(nèi)為粉末顆粒間的微孔，紅圈部分為設(shè)計(jì)孔道圖5 骨支架的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of bone scaffolds

2.5 細(xì)胞增殖和分化結(jié)果

為了評(píng)價(jià)所制備骨支架的生物兼容性，將小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別在8種骨支架上培養(yǎng)3、7和14 d后，測(cè)量、觀察各骨支架細(xì)胞增殖的吸光值(OD值)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可看出：8組支架上均能夠培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。開始前 3 d，8種支架的 OD 值均在上升，到第7天測(cè)量時(shí)，8種支架 OD 值均大于第3天測(cè)量值，其中H6040支架的 OD值是磷酸骨支架中達(dá)到最大的(分別為H100、H2080和H4060 的 222.58%、127% 和 106.15%)；而P6040支架的 OD值則在聚乙烯醇骨支架中達(dá)到最大(分別為P100、P2080和P4060 的 234.28%、115.49% 和 103.79%)。無(wú)論是磷酸骨支架還是聚乙烯醇骨支架，當(dāng)HA和β-TCP的復(fù)合比例為60∶ 40時(shí)，骨支架的OD值達(dá)到最大值，表明HA和β-TCP復(fù)合比例為60∶ 40的人工骨支架更加有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，第14天測(cè)量結(jié)果表明8組支架的 OD值均小于第7天時(shí)的測(cè)量值，即培養(yǎng)后期所有支架的OD值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是由于經(jīng)過(guò)前期的培養(yǎng)，細(xì)胞逐漸成熟并進(jìn)入礦化階段(mineral stage)，從而導(dǎo)致 OD值減少。由于8種支架的OD值在前 7 d均呈上升趨勢(shì)，因此所制備的8種支架均具有骨生長(zhǎng)及骨化能力。

3 結(jié)論

首先使用 3D打印技術(shù)制備了具有連通孔道的HA/β-TCP骨支架，為了比較不同黏結(jié)劑及復(fù)合比例對(duì)骨支架性能的影響，分別選用磷酸和聚乙烯醇制備了不同復(fù)合比例的骨支架。其次，通過(guò)測(cè)量孔隙率、強(qiáng)度試驗(yàn)、電鏡掃描及細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，分別從微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能及生物兼容性方面分析了所制備各組骨支架的性能。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用磷酸作為黏結(jié)劑的骨支架具有更加優(yōu)越的力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步表明磷酸骨支架比聚乙烯醇骨支架具有更好的生物相容性?；诒疚慕Y(jié)果，磷酸骨支架(H6040)更有可能在臨床試驗(yàn)中取得成功。

本研究將HA與β-TCP制備成復(fù)合材料，可集兩單組分材料的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)二者各自的缺陷，是一種性能優(yōu)良的生物骨材料。因此，HA/β-TCP合適的復(fù)合比例對(duì)于磷酸鈣材料在組織工程的應(yīng)用提供了有利條件。