彭 鋼，俞亞東，陳曉君，黃 和

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；2.江蘇先進生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210009；3.南京工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇南京211800；4.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇南京211800)

隨著中國經(jīng)濟的增長和人民生活水平的不斷提高，健康問題和食品安全成為人們關(guān)注的焦點，人類的各種疾病基本都是遺傳因素與環(huán)境因素共同導(dǎo)致的[1]；同時，轉(zhuǎn)基因食品的安全性和食品摻假是食品安全中被普遍關(guān)注的問題[2]。鑒于此，發(fā)展基因檢測技術(shù)對基因疾病診斷、疾病預(yù)防性基因體檢和食品安全檢測尤為重要。目前基因檢測常用方法有熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)[3]、基因芯片[4]、液態(tài)生物芯片[5]、微流控技術(shù)[6]、Northern和Western印跡[7]等技術(shù)。盡管這些方法具有靈敏度高、準確性強等優(yōu)點，但對儀器的要求較高，而且需要對樣品進行繁瑣的前處理，成本高、耗時長，不適于大量樣品的現(xiàn)場快速檢測。與其他方法相比，電化學(xué)傳感器具有制備簡單、成本低、耗時短等優(yōu)點，成為基因檢測的研究熱點。但是，開發(fā)性能優(yōu)異的電化學(xué)傳感器需要做到以下兩點：①傳感器界面的構(gòu)建；②電信號的放大。然而傳感器界面的構(gòu)建和電信號的放大離不開優(yōu)異性能的材料。

納米材料具有獨特的優(yōu)勢，如體積效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、介電限域效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)，使其在電化學(xué)傳感器領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，納米尺度下的新型二維材料，如石墨烯及其復(fù)合材料等，具有優(yōu)異的物理化學(xué)性能，為探索開發(fā)快速、靈敏、低成本、穩(wěn)定的基因檢測新方法帶來了希望[8-11]。本文中，筆者就近年來基于石墨烯復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器在基因檢測領(lǐng)域的研究進行綜述。

1 石墨烯特性

石墨烯是由純碳原子六元環(huán)平面結(jié)構(gòu)構(gòu)成的、只有一層原子厚度的二維晶體[12]。它可以翹曲成零維的富勒烯，卷成一維的碳納米管或者堆垛成三維的石墨[13](圖1)。2004年，英國曼徹斯特大學(xué)物理學(xué)家安德烈·蓋姆和康斯坦丁·諾沃肖洛夫，首次利用機械剝離的方法成功從石墨中分離出石墨烯，證實它可以單獨存在，推動了科學(xué)家們對二維納米材料的研究熱情[14]。石墨烯具有非常大的理論比表面積、很高的力學(xué)強度[15]、超高的光學(xué)透過率、優(yōu)良的導(dǎo)熱性[16]、高導(dǎo)電性和熒光猝滅特性等。石墨烯更為奇特之處是它具有獨特的電子結(jié)構(gòu)和電學(xué)性質(zhì)，能隙為0，而且石墨烯中電子的運動速度達到光速的1/300[17]。石墨烯具有的奇特性質(zhì)，使得其能夠滿足高靈敏性傳感器設(shè)計的需求，為發(fā)展基因檢測技術(shù)帶來希望。

圖1 石墨烯翹曲成零維富勒烯，卷成一維碳納米管 或者堆垛成三維的石墨[13]Fig.1 Graphene can be wrapped up into 0D fullerenes, rolled into 1D nanotubes or stacked into 3D graphite[13]

2 石墨烯的制備方法

由于單層或多層石墨烯材料廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，而且自然界中石墨烯以堆疊成石墨形式存在，促成制備高質(zhì)量、大面積、尺寸可控、層數(shù)可控的石墨烯方法不斷發(fā)展。目前，石墨烯的制備方法可分為物理方法和化學(xué)方法。物理方法包括機械剝離法[18-19]、液相直接剝離法[20-22]等；化學(xué)方法包括氧化石墨還原法[23-27]、化學(xué)氣相沉積法(CVD)[28-32]等，表1總結(jié)了幾種常用的石墨烯制備方法。

表1 石墨烯制備的常用方法

然而，上述方法制備石墨烯，存在著不能同時滿足制備出尺寸大、質(zhì)量好、精確控制納米片的層數(shù)、容易轉(zhuǎn)移到其他基體、成本低等需求的問題(表2)。因而，石墨烯的制備仍將是今后研究的重點。

表2 幾種常見的石墨烯制備方法優(yōu)缺點比較

3 石墨烯復(fù)合材料電化學(xué)傳感器在基因檢測中的應(yīng)用

石墨烯獨特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的性能引起了研究者極大的興趣，但單一的石墨烯材料往往因為團聚，難以發(fā)揮其優(yōu)異的性能，最近研究發(fā)現(xiàn)石墨烯復(fù)合材料可以有效地抑制石墨烯的不可逆團聚，充分發(fā)揮石墨烯以及石墨烯復(fù)合材料的優(yōu)異性能[33]。基于石墨烯的復(fù)合材料是石墨烯應(yīng)用領(lǐng)域中的重要研究方向之一，在能量儲存[34]、液晶器件[35]、生物成像[36]和傳感器件[37]等領(lǐng)域展現(xiàn)出了優(yōu)良性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)組分不同，石墨烯復(fù)合材料可分為石墨烯/無機復(fù)合材料、石墨烯/有機復(fù)合材料、石墨烯/有機/無機復(fù)合材料和其他石墨烯復(fù)合材料，將進行詳細討論。

3.1 石墨烯/無機復(fù)合材料

石墨烯/無機物納米復(fù)合材料是通過一步法或多步法合成的。Chen等[38]通過一步水熱法合成了氮摻雜石墨烯/Fe3O4粒子復(fù)合材料，并構(gòu)建了電化學(xué)傳感器應(yīng)用于DNA的檢測。Hajihosseini等[39]通過兩步法將石墨烯/納米金復(fù)合材料修飾在電極表面構(gòu)成一個傳感器，并應(yīng)用于DNA的檢測。在復(fù)合材料中，無機納米粒子可以增加石墨烯的片層間距，阻礙石墨烯的不可逆團聚，保留單層石墨烯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；而且，無機納米粒子和石墨烯之間的協(xié)同效應(yīng)使得復(fù)合材料擁有了更加優(yōu)異的性能。

Chen等[40]利用氧化石墨烯、氨水和水合肼一步水熱合成了氮摻雜石墨烯，乙二醇作為還原劑制備了氮摻雜石墨烯/納米金復(fù)合物，構(gòu)建了一種基于氮摻雜石墨烯/納米金復(fù)合物的電化學(xué)生物傳感器(圖2)，在最優(yōu)條件下，采用差分脈沖伏安法檢測人類多藥耐藥基因的線性范圍為1.0×10-14～1.0×10-7mol/L，檢出限為3.12×10-15mol/L。Wang等[41]采用電化學(xué)沉積法制備了石墨烯/納米金修飾玻碳電極，在最優(yōu)條件下，對目標DNA的檢測范圍為1.0×10-16～1.0×10-7mol/L，檢測限為3.5×10-17mol/L。Jafari等[42]制備了氧化鈰納米粒子/石墨烯復(fù)合物，將其修飾到玻碳電極表面，構(gòu)建DNA傳感器，對DNA的線性響應(yīng)范圍為1.0×10-15～1.0×10-8mol/L，檢出限為1.0×10-16mol/L。Teymourian等[10]制備了Fe3O4納米粒子/石墨烯復(fù)合材料應(yīng)用于DNA檢測，線性響應(yīng)范圍為1.0×10-17～1.0×10-10mol/L。Shuai等[43]制備出MgO納米粒子/納米金/石墨烯復(fù)合材料，構(gòu)建了RNA電化學(xué)傳感器，獲得的線性響應(yīng)范圍為1.0×10-16～1.0×10-13mol/L，檢出限為5.0×10-17mol/L?？梢?，石墨烯/無機復(fù)合材料被應(yīng)用到基因檢測領(lǐng)域并得到快速發(fā)展。筆者總結(jié)了近幾年石墨烯/無機復(fù)合材料在基因檢測方面的研究應(yīng)用，匯總于表3。

圖2 電化學(xué)DNA傳感器構(gòu)建流程[40]Fig.2 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[40]

復(fù)合材料檢測對象線性范圍/(mol·L-1)檢出限/(mol·L-1)文獻石墨烯/氧化鎳DNA1.0×10-13～1.0×10-63.12×10-14[44]石墨烯/氧化鋯DNA1.0×10-13～1.0×10-63.23×10-14[45]石墨烯/納米銀DNA1.0×10-14～1.0×10-87.6×10-15[46]石墨烯/納米金DNA5.0×10-16～5.0×10-113.6×10-16[47]石墨烯/氧化釔DNA1.0×10-17～1.0×10-95.95×10-18[48]石墨烯/納米金/氧化鎂RNA1.0×10-16～1.0×10-135.0×10-17[43]石墨烯/二硫化鎢DNA1.0×10-14～5.0×10-102.3×10-15[49]

3.2 石墨烯/有機復(fù)合材料

石墨烯中的π-π共軛結(jié)構(gòu)能夠通過π-π堆積作用被有機物功能化，同時，石墨烯被羧基化或羥基化后也能夠通過共價鍵連接有機物，形成石墨烯/有機復(fù)合材料。Zainudin等[11]利用π-π堆積作用制備了1-吡啶酸/石墨烯復(fù)合材料，構(gòu)建了阻抗型電化學(xué)傳感器應(yīng)用于檢測大腸桿菌DNA，線性檢測范圍為1.0×10-14～1.0×10-10mol/L，檢出限為7.0×10-16mol/L。Zhang等[50]依據(jù)π-π堆積作用合成了色胺/石墨烯復(fù)合材料，然后修飾到玻碳電極表面，構(gòu)成無標記的DNA電化學(xué)傳感器(圖3)，通過阻抗分析獲得線性檢測范圍為1.0×10-12～1.0×10-7mol/L，檢出限為5.2×10-13mol/L。Li等[51]利用全氟磺酸/石墨烯修飾絲網(wǎng)印刷碳電極，以胭脂紅酸為信號探針，構(gòu)建了DNA電化學(xué)傳感器用于目標HIV-1序列的檢測。在最優(yōu)條件下，獲得的線性檢測范圍為4.0×10-8～2.56×10-6mol/L，檢出限為5.0×10-9mol/L。Tran等[52]制備了碳納米管/石墨烯復(fù)合物，將其修飾到絲網(wǎng)印刷金電極表

面，并利用辣根過氧化物酶催化系統(tǒng)進行信號放大，構(gòu)建了RNA傳感器，線性范圍1.0×10-14～1.0×10-10mol/L。由于有機物種類多，因此，石墨烯/有機復(fù)合材料電化學(xué)傳感器在基因檢測中的應(yīng)用潛力巨大。筆者總結(jié)了近幾年石墨烯/有機復(fù)合材料在基因檢測方面的研究應(yīng)用，匯總于表4。

圖3 電化學(xué)DNA傳感器構(gòu)建流程[50]Fig.3 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[50]

表4 基于石墨烯/有機復(fù)合材料電化學(xué)傳感器在基因檢測中的應(yīng)用實例

3.3 石墨烯/有機/無機復(fù)合材料

為了充分發(fā)揮各種材料的性能以及完善石墨烯納米復(fù)合材料的不足，研究人員進一步合成了石墨烯/有機/無機復(fù)合材料。有機物富含芳香基團和各種官能團，易于與石墨烯結(jié)合，同時還可以用作石墨烯與無機物結(jié)合的橋梁，例如，Yola等[56]首先利用巰基乙胺使石墨烯富含巰基，再通過金-巰鍵結(jié)合金鐵納米復(fù)合物合成了石墨烯/有機物/無機物復(fù)合材料，并用堿性藍41作為信號分子，構(gòu)建了高靈敏的DNA電化學(xué)傳感器應(yīng)用于DNA檢測，獲得了較好的線性范圍1.0×10-14～1.0×10-8mol/L，檢出限為2.0×10-15mol/L。Shi等[9]首先通過滴涂將石墨烯固定在電極表面，然后通過π-π堆積作用將帶負電的聚苯乙烯磺酸固定在電極表面，最后通過靜電作用將帶正電的金納米棒固定在電極表面，以阿霉素為信號分子，構(gòu)建DNA電化學(xué)傳感器用于目標DNA檢測(圖4)，通過差分脈沖伏安法分析獲得線性檢測范圍為1.0×10-16～1.0×10-9mol/L，檢出限為3.5×10-17mol/L。Huang等[57]首先將石墨烯與納米金修飾在玻碳電極表面，然后通過循環(huán)伏安法將硫堇沉積在電極表面形成石墨烯/納米金/硫堇復(fù)合物，以1,10-鄰菲咯啉二氯合釕為信號分子，構(gòu)建DNA電化學(xué)傳感器用于人乳頭瘤病毒DNA檢測，獲得線性檢測范圍為1.0×10-13～1.0×10-10mol/L，檢出限為4.03×10-14mol/L。Liu等[58]合成了聚酰胺-胺型樹狀大分子/銀金納米簇復(fù)合物，通過酰胺鍵與修飾在電極表面的石墨烯結(jié)合，形成石墨烯/聚酰胺-胺型樹狀大分子/銀金納米簇復(fù)合物，并利用辣根過氧化物酶催化作用對信號進行放大，構(gòu)建RNA電化學(xué)傳感器應(yīng)用于microRNA-126檢測，線性響應(yīng)范圍為1.0×10-15～1.0×10-8mol/L，檢出限為7.9×10-16mol/L。不難看出，石墨烯/有機/無機復(fù)合物材料充分發(fā)揮了各自的特性，具有協(xié)同效應(yīng)，這將為發(fā)展更優(yōu)異的電化學(xué)基因檢測傳感器帶來希望。筆者總結(jié)了近幾年石墨烯/有機/無機復(fù)合材料在基因檢測方面的研究應(yīng)用，匯總于表5。

圖4 電化學(xué)DNA傳感器構(gòu)建流程[9]Fig.4 Schematic representation of the electrochemical DNA biosensor[9]

復(fù)合材料檢測對象線性范圍/(mol·L-1)檢出限/(mol·L-1)文獻石墨烯/巰基乙胺/納米金鐵DNA1.0×10-14～1.0×10-82.0×10-15[56]石墨烯/殼聚糖/二硫化釩DNA5.0×10-13～5.0×10-105.2×10-14[59]石墨烯/聚苯乙烯磺酸/金納米棒DNA1.0×10-16～1.0×10-93.5×10-17[9]石墨烯/納米金/聚硫堇DNA1.0×10-13～1.0×10-104.03×10-14[57]石墨烯/氧化鐵/聚黃尿酸DNA1.0×10-16～1.0×10-93.2×10-17[60]石墨烯/聚苯胺/納米金DNA1.0×10-11～2.0×10-81.05×10-12[61]石墨烯/聚酰胺胺/銀金納米RNA1.0×10-15～1.0×10-87.9×10-16[58]石墨烯/鐵酸鎳/殼聚糖DNA1.0×10-16～1.0×10-61.0×10-16[62]石墨烯/碳納米管/納米金DNA1.0×10-16～5.0×10-103.3×10-17[63]石墨烯/殼聚糖/聚苯胺/納米金DNA1.0×10-11～5.0×10-92.11×10-12[64]石墨烯/氧化鋅/1芘丁酸琥珀酰亞胺酯RNA1.0×10-11～1.0×10-64.3×10-12[65]

3.4 其他石墨烯復(fù)合材料

石墨烯還可以與其他材料如血紅素、酶和DNA形成復(fù)合材料，賦予復(fù)合材料更好的生物相容性。Ye等[66]利用血紅素將石墨烯功能化固定在電極表面，然后通過電沉積將納米金固定在電極表面，構(gòu)成DNA電化學(xué)傳感器用于DNA檢測，獲得的線性檢測范圍為1.0×10-18～1.0×10-13mol/L，檢出限為1.4×10-19mol/L。Hu等[67]利用石墨烯量子點作為載體固定辣根過氧化物酶進行信號放大，構(gòu)建RNA電化學(xué)傳感器，檢測miRNA-155時獲得的線性范圍為1.0×10-15～1.0×10-10mol/L，檢出限為1.4×10-16mol/L。更多的石墨烯復(fù)合材料有待研究者進一步研究和開發(fā)，使其在電化學(xué)基因檢測中的應(yīng)用越來越多。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，石墨烯復(fù)合材料在電化學(xué)基因傳感的應(yīng)用中展現(xiàn)出了優(yōu)越的性能，主要歸因于：1)石墨烯具有大的比表面積、高的導(dǎo)電性和良好的生物相容性；2)石墨烯復(fù)合材料中各組分之間相互的協(xié)同效應(yīng)。同時，筆者也發(fā)現(xiàn)研究中存在的一些不足：1)石墨烯尺寸的不均勻性影響了傳感器的靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；2)石墨烯復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)缺陷明顯地影響了其電子傳遞性能，而且復(fù)合材料中各組分比例不同也會影響復(fù)合材料的綜合性能。

為了使石墨烯復(fù)合材料在基因檢測分析中有更好的應(yīng)用前景，筆者提出兩點建議：1)研發(fā)更加溫和地制備均勻石墨烯的方法；2)制備石墨烯復(fù)合材料時，深入研究各組分比例對復(fù)合材料性質(zhì)及傳感性能的影響。相信隨著科學(xué)家們不斷的研究和新技術(shù)的成熟，基于石墨烯復(fù)合材料電化學(xué)傳感器在實際基因檢測中將有廣闊的應(yīng)用前景。