孫曉玉, 宋曉紅, 劉雅瓊,2, 楊思宇, 李月琪, 趙倩倩, 王京宇,2

(1. 北京大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院, 北京 100191； 2. 北京大學(xué) 醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心, 北京 100191； 3. 島津企業(yè)管理(中國)有限公司北京分析中心, 北京 100020)

如何高效利用血清進(jìn)行多元素定量分析已成為分析檢測(cè)領(lǐng)域一個(gè)重要的課題[1]。生命科學(xué)的研究已進(jìn)入多組學(xué)時(shí)代,金屬組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)等研究都需消耗較多血液樣品[2]。然而研究中收集的血清樣品量通常十分有限,若進(jìn)行常規(guī)金屬組學(xué)元素分析就消耗較多的血清樣品,將會(huì)限制血清多組學(xué)同步研究。

微波消解已廣泛應(yīng)用于樣品前處理,但血清樣品中元素含量較低,微波消解過程會(huì)引入外來元素污染及易揮發(fā)元素?fù)p失,且操作成本高,不適于大規(guī)模樣品檢測(cè)[3]。相關(guān)研究表明,采用直接稀釋法對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理可滿足檢測(cè)需求,但需選擇合適的稀釋倍數(shù)以減少基體干擾[4]。電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)進(jìn)行常規(guī)樣品分析時(shí),較多的待測(cè)液浪費(fèi)在浸潤管路,只有小部分待測(cè)液產(chǎn)生的信號(hào)真正被檢測(cè)器收集[5]。

本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化ICP-OES血清多元素定量分析過程中前處理方法、信號(hào)采集延遲時(shí)間和采樣留置時(shí)間等,提高樣品使用效率。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及試劑

主要設(shè)備:ICP-OES：日本島津公司(Shimadzu),ICPE 9800。

主要試劑：

單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液有Na、S、P、K、Ca、Fe、Mg、Zn、Cu、Y。

質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：Trace Elements Serum L-1,挪威SERO公司,REF：201405,LOT：1309438。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ICP-OES工作條件

ICP-OES2工作條件見表1。

表1 ICP-OES工作條件

2.2 樣本

合作醫(yī)院體檢健康的成年人,空腹靜脈血離心所得血清,置-20 ℃冷藏備用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過北京大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

2.3 樣品前處理

用1% HNO3將血清直接稀釋10、20、40倍，制成不同濃度待測(cè)液,同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)元素Y,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為200 μg/L。

2.4 確定最小進(jìn)樣體積

(1) 確定信號(hào)采集延遲時(shí)間：將ICPE 9800信號(hào)采集延遲時(shí)間分別設(shè)置成14、16、18……32 s等,在不同信號(hào)采集延遲時(shí)間下分別檢測(cè)待測(cè)液。檢測(cè)過程中,儀器連續(xù)曝光3次,并分別報(bào)告3次曝光測(cè)定值。默認(rèn)情況下,最終測(cè)定結(jié)果是3次曝光測(cè)定值的平均值。以K元素為參考元素,分析K元素3次曝光測(cè)定值隨信號(hào)采集延遲時(shí)間的變化趨勢(shì),確定最佳信號(hào)采集延遲時(shí)間。

(2) 確定采樣留置時(shí)間：按照上一步結(jié)果設(shè)定信號(hào)采集延遲時(shí)間,進(jìn)樣管置于待測(cè)液時(shí)開始測(cè)定。測(cè)定時(shí)將進(jìn)樣管分別留置于待測(cè)液內(nèi)10、12、14……28 s后取出置于清洗液中。以K元素為參考元素,分析K元素3次曝光測(cè)定值隨采樣留置時(shí)間的變化趨勢(shì),確定最佳采樣留置時(shí)間。

(3) 確定最小取樣量：根據(jù)信號(hào)采集延遲時(shí)間和采樣留置時(shí)間確定血清最小取樣量。

2.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)血清中各待測(cè)元素的濃度,配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,應(yīng)用本研究所建方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液,建立各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線。各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線中各元素的質(zhì)量濃度

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 血清前處理

測(cè)定不同稀釋倍數(shù)的血清樣品,結(jié)果表明血清樣品直接稀釋10倍和20倍時(shí),精密度較差,稀釋40倍時(shí)精密度較好(見表3)。同時(shí),稀釋10倍和20倍時(shí)易造成ICP-OES進(jìn)樣系統(tǒng)堵塞及ICP火焰熄滅,稀釋40倍時(shí)則有效避免上述情況。因此,采用40倍直接稀釋進(jìn)行血清樣品前處理。

表3 不同稀釋倍數(shù)下各元素精密度(n=10)

3.2 信號(hào)采集延遲時(shí)間

不同信號(hào)采集延遲時(shí)間下K元素的信號(hào)強(qiáng)度見圖1。

圖1 不同信號(hào)采集延遲時(shí)間下鉀元素的信號(hào)強(qiáng)度

由圖1可知：3次曝光測(cè)定值隨信號(hào)采集延長時(shí)間的增加變化不同,第1次曝光測(cè)定值在信號(hào)采集延遲時(shí)間為14～24 s內(nèi)快速升高,26 s后達(dá)到穩(wěn)定；第2次曝光測(cè)定值在信號(hào)采集延遲時(shí)間為14～18 s內(nèi)快速升高,20 s后達(dá)到穩(wěn)定；第3次曝光測(cè)定值在信號(hào)采集延遲時(shí)間為14～32 s內(nèi)均保持穩(wěn)定。

已知每次曝光時(shí)間為5 s,則3次曝光的信號(hào)采集時(shí)間為15 s。當(dāng)信號(hào)采集延遲時(shí)間設(shè)置較短時(shí),雖測(cè)定已開始,但血清待測(cè)液并未到達(dá)ICP火焰或其信號(hào)未達(dá)到平衡。因此,只有當(dāng)血清待測(cè)液進(jìn)入到ICP中且信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定時(shí),檢測(cè)器才應(yīng)采集信號(hào)。根據(jù)第1次曝光測(cè)定值的趨勢(shì)可知,信號(hào)采集延遲時(shí)間大于28 s時(shí),3次曝光所采集的信號(hào)均為血清待測(cè)液的穩(wěn)定信號(hào)。因此,將最佳信號(hào)采集延遲時(shí)間定為28 s。

3.3 采樣留置時(shí)間

不同采樣留置時(shí)間下K元素的信號(hào)強(qiáng)度見圖2。

圖2 不同采樣留置時(shí)間下鉀元素的信號(hào)強(qiáng)度

由圖2可知：3次曝光測(cè)定值隨采樣留置時(shí)間的增加變化不同,第1次曝光測(cè)定值在10～28 s內(nèi)均保持穩(wěn)定；第2次曝光測(cè)定值在10～16 s內(nèi)快速升高,之后達(dá)到穩(wěn)定；第3次曝光測(cè)定值在10～14 s內(nèi)保持在1 550左右,14～22 s內(nèi)快速升高,之后達(dá)到穩(wěn)定。

當(dāng)采樣留置時(shí)間較短時(shí),進(jìn)入到儀器內(nèi)的待測(cè)液無法滿足3次曝光所需體積。根據(jù)第3次曝光測(cè)定值的趨勢(shì)可知,當(dāng)采樣留置時(shí)間大于24 s時(shí),3次曝光所采集的信號(hào)均為血清待測(cè)液的穩(wěn)定信號(hào)。因此,將最佳采樣留置時(shí)間定為24 s。

3.4 最小進(jìn)樣量

將進(jìn)樣管插入某一血清稀釋液內(nèi),記錄10 min內(nèi)血清稀釋液消耗體積。結(jié)果可知,10 min約消耗11.8 mL血清稀釋液,則每秒消耗約20 μL血清稀釋液。由采樣留置時(shí)間為24 s可知,完成一次檢測(cè)約需0.48 mL血清稀釋液,即12μL血清原液。鑒于進(jìn)樣過程中有部分待測(cè)液會(huì)殘留在進(jìn)樣管或EP管中,故在實(shí)際操作中取15 μL血清于EP管中,用1% HNO3稀釋40倍至0.60 mL待測(cè)。

3.5 進(jìn)樣系統(tǒng)清洗時(shí)間

采用本研究所建方法進(jìn)行測(cè)定,調(diào)整清洗時(shí)間為10、15、20 s,觀察清洗效果發(fā)現(xiàn),清洗15 s以上時(shí),信號(hào)已回到基線水平。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

各元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)見表4。

表4 各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)r

3.7 檢測(cè)限和方法精密度

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)測(cè)定11份空白溶液,以11次空白值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)濃度為各元素的檢出限,10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)濃度為定量下限(見表5)。

表5 各元素檢出限與定量下限

表5(續(xù))

應(yīng)用該方法對(duì)相同血清樣品進(jìn)行6次獨(dú)立測(cè)定,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差得到日內(nèi)精密度；應(yīng)用該方法對(duì)相同的血清樣品連續(xù)測(cè)定6 d,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差得到日間精密度,結(jié)果見表6。

表6 各元素精密度(n=6)

注：*均值單位：mg/L,#均值單位：μg/L。

從表6可知,Na、S、K、P、Ca、Mg、Fe、Cu和Zn元素的日內(nèi)精密度RSD均小于2%,日間精密度RSD均小于3%。

3.8 加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)是在測(cè)定樣品的同時(shí),于某一樣品的子樣中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并進(jìn)行測(cè)定,將其測(cè)定結(jié)果扣除樣品的測(cè)定值。得到加標(biāo)回收率見表7。

表7 各元素加標(biāo)回收率(n=6)

注：*測(cè)定值、加標(biāo)量和加標(biāo)試樣測(cè)定值單位：mg/L,#測(cè)定值、加標(biāo)量和加標(biāo)試樣測(cè)定值單位：μg/L。

由表7可知,Na、S、K、P、Ca、Mg、Fe和Cu元素的加標(biāo)回收率均在100.0%～105.0%之間,Zn元素的加標(biāo)回收率均為110.5%。

3.9 血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)

人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見表8。

表8 血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(n=6)

注：*測(cè)定值和參考值單位：mg/L,#測(cè)定值和參考值單位：μg/L。

由表8可知,Na、P、K、Ca、Mg、Fe、Zn和Cu元素的人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定值都在參考值范圍內(nèi),該人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不含S元素。

4 討論

任何樣品在進(jìn)行檢測(cè)之前都需要經(jīng)過一定的前處理,徐進(jìn)力等[6]的研究表明,采用直接稀釋進(jìn)行前處理時(shí),如果稀釋倍數(shù)較低,則進(jìn)樣系統(tǒng)易發(fā)生堵塞進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；如果稀釋倍數(shù)過大,則又會(huì)因元素含量過低而達(dá)不到理想的靈敏度,其分析信號(hào)強(qiáng)度將顯著減弱,檢測(cè)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大的誤差。稀釋倍數(shù)較低條件下,隨著檢測(cè)樣品數(shù)量的增加,無機(jī)鹽會(huì)沉積在炬管、霧化器和霧化室中,導(dǎo)致樣品測(cè)定值產(chǎn)生波動(dòng)[7]。本研究的結(jié)果與上述一致,將血清直接稀釋10倍和20倍時(shí),進(jìn)樣系統(tǒng)易堵塞并導(dǎo)致ICP火焰熄火,且血清樣品在較低稀釋倍數(shù)下測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性較差。因此本研究選用40倍稀釋是相對(duì)合理的血清稀釋倍數(shù)。當(dāng)然,對(duì)于濃度較低的待測(cè)元素,在樣品數(shù)不多的前提下也可以采用10倍或者20倍稀釋,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4%(參見表3)。

本研究所用儀器默認(rèn)設(shè)置信號(hào)采集延遲時(shí)間為30 s,曝光時(shí)間每次30 s、清洗時(shí)間30 s,且需在待測(cè)液充滿管路后才能開始檢測(cè)過程,因此默認(rèn)條件下測(cè)定一個(gè)樣品至少需150 s,而實(shí)際測(cè)定過程往往更長。本研究所建方法將信號(hào)采集時(shí)間與檢測(cè)時(shí)間相結(jié)合,利用浸潤管路的溶液進(jìn)行測(cè)定,只需進(jìn)樣24 s即可準(zhǔn)確測(cè)定。此外,由于進(jìn)樣體積減少,故只需15 s即可完成清洗過程。因此,采用本方法只需39 s即可完成一個(gè)檢測(cè)周期,相較默認(rèn)方法節(jié)省80%的樣品消耗量和74%的檢測(cè)時(shí)間,且測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

常規(guī)方法進(jìn)行血清多元素分析時(shí),往往需要0.2～0.5 mL血清才能完成一個(gè)樣品的測(cè)定[8-10]。李海龍等[11]進(jìn)行血清中多種元素的電感耦合等離子體發(fā)射光譜法直接測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí),提取0.4 mL血清,直接稀釋定容到10.0 mL后上機(jī)測(cè)定。李萌等[12]進(jìn)行血清多元素分析時(shí),取0.5 mL血清處理后定容到2.1 mL后上機(jī)測(cè)定。嚴(yán)海英等[13]利用微波消解測(cè)定疾病人群血清中的微量元素時(shí),取1.0 mL血清,前處理后定容到10.0 mL上機(jī)測(cè)定。本研究建立的微量血清多元素定量分析方法僅需約15 μL血清,顯著減少了血清樣本消耗量,有望實(shí)現(xiàn)指血、足跟血、耳血中多元素定量分析和滿足嬰幼兒檢測(cè)需求。

5 結(jié)論

本研究采用直接稀釋的前處理方法,對(duì)ICP-OES進(jìn)樣技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種微量血清多元素定量分析的方法,測(cè)定了血清中Na、S、K、P、Ca、Mg、Fe、Zn和Cu元素的含量,并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,該方法較默認(rèn)方法節(jié)省80%的血清樣品和74%的檢測(cè)時(shí)間,且測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,提高了血清樣本利用效率,有利于多組學(xué)生同步研究的順利開展。