馮芳　肖虹

【摘要】 目的：研究新型的分泌型促血管生成因子CNPY2在胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與侵襲、轉(zhuǎn)移及微血管密度之間的關(guān)系。方法：收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本50例，采用western-blot檢測(cè)CNPY2的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)CD34染色計(jì)數(shù)微血管密度，分析CNPY2的表達(dá)與患者臨床病理特征及微血管密度之間的關(guān)系。結(jié)果：與癌旁組織相比，胃癌組織中CNPY2的表達(dá)顯著增高（P<0.05）；CNPY2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05），CNPY2在Ⅲ期+Ⅳ期腫瘤組織中的表達(dá)高于Ⅰ期+Ⅱ期（P<0.05）；CNPY2高表達(dá)的胃癌組織中腫瘤微血管密度顯著增高（P<0.05）；與腫瘤原發(fā)灶相比，CNPY2在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：CNPY2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能在胃癌血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】 胃癌； CNPY2； 微血管密度

Expression of CNPY2 in Gastric Cancer and Its Relationship with Invasion，Metastasis and Microvessel Density/FENG Fang，XIAO Hong.//Medical Innovation of China，2018，15（23）：0-038

【Abstract】 Objective：To study the expression of a novel secreted pro-angiogenic factor CNPY2 in gastric cancer and to analyze its relationship with invasion，metastasis and microvessel density.Method：Fifty cases of gastric cancer tissues and adjacent tissues were collected from the First Hospital of Shanxi Medical University.The expression of CNPY2 was detected by western-blot and microvessel density using immunohistochemistry CD34 staining.The relationship between CNPY2 expression and clinicopathological features and microvessel density was analyzed.Result：The expression of CNPY2 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in adjacent non-cancerous tissues（P<0.05）.The expression of CNPY2 in lymph node metastasis was higher than that in non-lymph node metastasis（P<0.05）.The expression of CNPY2 in stage Ⅲ+Ⅳ tumor was higher than that in stage Ⅰ+Ⅱ（P<0.05）.The density of tumor microvessel was significantly higher in CNPY2-overexpressing gastric cancer（P<0.05）.Compared with the primary tumor，the expression of CNPY2 in metastatic lymph node tissue was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：The up-regulation of CNPY2 in gastric cancer may play an important role in angiogenesis，invasion and metastasis of gastric cancer.

【Key words】 Gastric cancer； CNPY2； Microvessel density

First-authors address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.23.009

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，在我國胃癌的發(fā)病率及死亡率僅次于肺癌，居于第二位[1]。雖然以外科治療為主的綜合治療取得了一定的進(jìn)展，但總體而言胃癌的預(yù)后不良[2]。腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移都依賴于腫瘤新生血管的生成[3-4]，CNPY2是一種新型胞漿分泌型蛋白，其生理作用主要是參與血管平滑肌細(xì)胞的生成和遷移、神經(jīng)突的生長[5-6]，在缺氧狀態(tài)下CNPY2可誘導(dǎo)血管生成，被認(rèn)為是一種分泌型血管生長因子[7-8]。據(jù)報(bào)道，CNPY2可能通過血管生成作用參與腫瘤的侵襲與進(jìn)展[9-10]，本研究定量分析了胃癌組織中CNPY2的表達(dá)情況及其與微血管密度之間的關(guān)系，為胃癌的研究提供新的思路和試驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果整理報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來源于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科2016年5月-2017年5月手術(shù)切除的胃癌組織，在不影響病理診斷的前提下留存癌組織及癌旁組織標(biāo)本，臨床可疑轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織術(shù)中行冰凍切片檢查，如可見癌轉(zhuǎn)移，則留取少許淋巴結(jié)組織，所有標(biāo)本立即置于-80 ℃低溫冰箱保存。入組患者均為初發(fā)、散發(fā)、無家族史，術(shù)前未經(jīng)任何形式的放、化療及靶向治療，術(shù)后經(jīng)常規(guī)石蠟切片病理診斷確診為胃腺癌。入組患者的臨床病例資料：男32例，女18例；年齡44～73歲，平均（55.2±9.9）歲；分化程度：高分化9例，中分化25例，低分化16例；Lauren分型：腸型33例，彌漫型17例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：未轉(zhuǎn)移27例，轉(zhuǎn)移23例；TNM分期（第八版）：Ⅰ期+Ⅱ期21例，Ⅲ期+Ⅳ期29例。試驗(yàn)經(jīng)患者知情同意，倫理審查通過，嚴(yán)格保護(hù)患者隱私。

1.2 主要試劑 兔源CNPY2一抗，美國proteintech公司；β-actin內(nèi)參一抗及抗兔二抗，美國santa-cruz公司；CD34一抗，北京中杉金橋生物公司；組織裂解液及BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物公司；蛋白分子量marker，武漢博士德生物公司；硝酸纖維素膜，北京索萊寶生物公司；甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺等其余試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 提取組織總蛋白：電子天平稱取組織0.5 g，眼科剪剪碎后加組織裂解液，于冰上勻漿，低溫離心取上清液，按照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒步驟檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳：配制分離膠及濃縮膠，灌膠至玻璃板中，凝固后上樣加入蛋白樣品及蛋白分子量marker。加入電泳緩沖液，預(yù)電泳30 min，電壓60 V。電泳45 min，電壓120 V。濕轉(zhuǎn)膜：將凝膠及硝酸纖維素膜夾至轉(zhuǎn)膜板中，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，轉(zhuǎn)膜25 min，電壓100 V。蛋白封閉：將裁好的膜置于5%蛋白干粉封閉液中，室溫輕搖1 h。顯色：CNPY2（1︰1 000）及β-actin（1︰1 000）一抗，4 ℃冰箱過夜反應(yīng)。滴加二抗（濃度1︰3 000）中，室溫輕搖1 h。采用ECL電化學(xué)發(fā)光法顯色，成像儀下曝光攝片。CNPY2的表達(dá)量以其與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示。

1.4 微血管密度檢測(cè) 石蠟包埋，4 μm切片至過膠玻片上，免疫組織化學(xué)二步法CD34染色，按說明書步驟進(jìn)行。CD34陽性表達(dá)部位定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)。微血管密度MVD計(jì)數(shù)方法：兩名病理醫(yī)師在多人共覽顯微鏡下共同計(jì)數(shù)，首先在低倍鏡（40倍）下選擇腫瘤浸潤生長明顯、間質(zhì)內(nèi)小血管最豐富的區(qū)域作為熱點(diǎn)區(qū)，在高倍鏡（200倍）計(jì)數(shù)熱點(diǎn)區(qū)微血管數(shù)量。計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取其平均值作為MVD數(shù)量[11-12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNPY2在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 蛋白印跡結(jié)果顯示，CNPY2在21 KDa處出現(xiàn)顯影條帶（圖1），經(jīng)灰度分析：CNPY2在胃癌組織中的表達(dá)為（0.972±0.233），顯著高于癌旁組織（0.224±0.093）（t=6.656，P=0.000）。在胃癌組織中，CNPY2在不同性別、年齡、分化程度及Lauren分型中的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期癌組織中的表達(dá)顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及TNMⅠ期+Ⅱ期（P<0.05），見表1。

2.2 CNPY2在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織及原發(fā)灶中的表達(dá) CNPY2在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的相對(duì)表達(dá)量為（1.507±0.451），與原發(fā)灶（0.867±0.168）相比，CNPY2在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.976，P=0.018），見圖2。

2.3 CNPY2的表達(dá)與MVD之間的關(guān)系 無論是否形成管腔結(jié)構(gòu)，CD34陽性標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)亦按獨(dú)立的微血管分別計(jì)數(shù)，不連通的血管小分支結(jié)構(gòu)也視為另一個(gè)微血管，有平滑肌細(xì)胞包繞的大血管或者管徑大于8個(gè)紅細(xì)胞的血管不視為微血管。CD34染色結(jié)果見圖3。以CNPY2表達(dá)的灰度值中位數(shù)為分界點(diǎn)，將其分為高表達(dá)及低表達(dá)組，低表達(dá)組胃癌組織MVD平均計(jì)數(shù)為（22.4±6.5），與低表達(dá)組相比，高表達(dá)組MVD計(jì)數(shù)（32.5±8.2）顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.575，P=0.033）。

3 討論

CNPY2是一種新型的分泌型促血管生成因子，人類CNPY2基因定位于12號(hào)染色體。屬于Canopy家族成員（CNPY1、2、3、4）中的一員，其基因編碼蛋白分子量約21 KDa，由182個(gè)氨基酸組成[13]。CNPY2在哺乳動(dòng)物機(jī)體各組織器官廣泛表達(dá)，尤其以胰腺、心臟及肝臟肝表達(dá)較高。Peng等[14]學(xué)者使用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)，免疫印跡和免疫組織化學(xué)分析檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系和組織中CNPY2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNPY2的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞系和組織中比正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和腫瘤鄰近的正常組織中顯著增加，并且可作為結(jié)直腸癌患者新的有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)。Yan等[15]學(xué)者的研究表明：CNPY2敲低阻止腫瘤生長和血管生成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在HCT116CRC細(xì)胞系中CNPY2的敲減可逆地增加p53活性，p53激活增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，減少細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并減少體內(nèi)和體外的血管生成。目前，CNPY2在腫瘤中的研究報(bào)道較少，在胃癌組織中尚未見相關(guān)報(bào)道。

本研究蛋白印跡定量分析結(jié)果表明，癌旁正常黏膜組織中CNPY2亦有表達(dá)，但其在胃癌組織中的相對(duì)灰度值顯著增高，提示CNPY2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。在胃癌組織中，CNPY2在不同性別、年齡、分化程度及Lauren分型中的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期癌組織中的表達(dá)均顯著高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及TNMⅠ期+Ⅱ期的癌組織，與原發(fā)灶相比，CNPY2在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，上述結(jié)果提示CNPY2的表達(dá)可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。惡性腫瘤的相對(duì)無限生長是血管依賴性的[16]，作為腫瘤基質(zhì)的重要組分，腫瘤新生血管可視為腫瘤增殖所必需的滋養(yǎng)系統(tǒng)，血管生成速度和密度是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要惡性表型[17-18]，微血管密度MVD被認(rèn)為是指血管形成活動(dòng)的標(biāo)志[19]。本研究以胃癌中CNPY2表達(dá)的灰度值中位數(shù)為分界點(diǎn)，將其分為高表達(dá)及低表達(dá)組，通過CD34染色計(jì)數(shù)腫瘤MVD，與低表達(dá)組相比，高表達(dá)組MVD的計(jì)數(shù)顯著增高，提示CNPY2可能通過腫瘤血管生成參與胃癌發(fā)生發(fā)展的病理過程。

綜上，CNPY2在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，可能通過血管生成作用在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，有望成為胃癌研究的有效預(yù)后因子和潛在基因靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-04-02） （本文編輯：張爽）