任凌燕 朱 鳴 霍麗霞 王霄一

局灶節(jié)段腎小球硬化癥（FSGS）發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)有研究主要聚焦在遺傳突變[1]、循環(huán)滲透因子[2]、機械應(yīng)力[3]等非免疫因素導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷與丟失。Zhang等[4]研究表明，F(xiàn)SGS伴隨著足細(xì)胞損傷及某些細(xì)胞因子的激活，但具體發(fā)病機制不清楚。Qu等[5]發(fā)現(xiàn)Kindlin-2通過與磷肌醇類、整合素的相互作用進一步調(diào)節(jié)足細(xì)胞黏附與纖維連接蛋白的沉積，提示Kindlin-2參與了腎小球疾病。Wei等[6]研究表明，敲低Kindlin-2可以有效減輕UUO小鼠的腎臟纖維化。本實驗通過建立小鼠局灶節(jié)段腎小球硬化癥-阿霉素腎病模型，探討Kindlin-2在局灶節(jié)段腎小球硬化癥模型小鼠足細(xì)胞損傷發(fā)病中的作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 8周齡健康雄性SPF級BALB/C小鼠36 只，體質(zhì)量（27.5±2.5）g，所有動物均采購自南京大學(xué)模式動物研究所，動物許可證號：SYXK（蘇）2015-0001，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房，溫度24～28℃，濕度75%左右，以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水及攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 阿霉素（adriamycin，ADR，北京索萊寶科技有限公司，批號H44024359，用生理鹽水配制成濃度2mg/mL）；兔抗鼠腎母細(xì)胞瘤（WT-1）多克隆抗體（abcam，批號 ab89901）；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物科技有限公司，批號ZF-0311）；小鼠尿微量白蛋白ELISA檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號E038）；小鼠血清白蛋白（ALB，南京建成生物科技有限公司，批號A028-1）；小鼠血清總膽固醇ELISA檢測試劑盒（TC，南京建成生物科技有限公司，批號C011-2）；總RNA提取試劑盒（TaKaRa公司，批號9108Q）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，批號RR047A）；PCR引物合成（上海生工生物合成有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 36只雄性BALB/C小鼠適應(yīng)環(huán)境1周，采用抽簽法隨機分為正常對照組和模型組，各18只。參照文獻[7]，模型組小鼠通過尾靜脈單次注射阿霉素（ADR）10mg/kg鼠重，正常對照組注射等容積的生理鹽水。

2.2 血液及尿液收集及測定 分別于給藥后第4、8、12周，每組隨機抽取6只，使用小鼠代謝籠收集24h尿液，采用小鼠心臟取血。按照ELISA試劑盒說明書步驟測定24h尿蛋白定量及血清白蛋白（ALB）、總膽固醇（TC）的水平。

2.3 腎臟組織取材及病理學(xué)改變 于造模結(jié)束后第4、8、12周每組隨機各處死6只小鼠，取其中一個腎組織的1/4固定于體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液，行PAS、MASSON染色，觀察兩組小鼠腎臟組織病理學(xué)變化情況。剩余3/4的腎臟組織用濕生理鹽水紗布包裹，存于液氮中備用。

圖3 兩組小鼠腎小球WT1表達（IHC ×400）

圖4 Kindlin-2mRNA水平與足細(xì)胞數(shù)量、Nephrin mRNA及Podocin mRNA水平相關(guān)性分析

2.4 WT1免疫組化計數(shù)足細(xì)胞數(shù)量 利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測WT1在兩組小鼠腎小球內(nèi)的表達，采用disector/fractionator方法計數(shù)兩組小鼠的足細(xì)胞數(shù)量[8]。

2.5 RT-qPCR 按照TaKaRa RNAiso Plus說明書提取組織總RNA。將已提取的組織總RNA按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于4°C冰箱備用。引物序列由上海生工生物合成有限公司合成，β-actin上游引物：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'；Kindlin-2 上游引物：5'-TGGACGGGATAAGGATGCCA-3'，下游引 物 ：5'-TGACATCGAGTTTTTCCACCAAC-3'；Podocin上游引物：5'-GCATCAAGCCCTCTGGATTAG-3'，下游引物：5'-AGACGGAGATCAACCTTGTGATA-3'；Nephrin 上游引物：5'-ATGGGAGCTAAGGAAGC CACA-3'，下游引物：5'-CCACACCACAGCTTAACTGTC-3'。于實時定量PCR儀進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)的條件：95℃預(yù)變性 3min，95℃變性 10s、60℃退火 30s、55℃延伸30s，共48個循環(huán)。以β-actin mRNA表達作為內(nèi)參照，以2^-△△ct表示mRNA的相對表達水平。行Kindlin-2 mRNA水平分別與Nephrin mRNA水平、Podocin mRNA水平的相關(guān)性分析。

圖1 兩組小鼠腎臟組織病理（PAS×200）

圖2 兩組小鼠腎臟組織病理（MASSON ×200）

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間差異比較采用重復(fù)測量方差分析。采用Spearman方法進行相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 兩組小鼠24h蛋白尿定量比較 模型組小鼠第4周24h尿蛋白定量顯著增加，并達到高峰，且大量蛋白尿一直持續(xù)到實驗結(jié)束，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見表 1。

表1 兩組小鼠24h尿蛋白定量比較（mg/24h，±s）

表1 兩組小鼠24h尿蛋白定量比較（mg/24h，±s）

注：與對照組相同時間點比較，*P＜0.05

組別正常對照組模型組鼠數(shù)6 6 4W 1.72±0.62 5.66±1.06*8W 1.77±0.63 4.63±1.16*12W 1.69±0.49 4.78±0.87*

3.2 兩組小鼠血清ALB、TG水平比較 模型組小鼠血清ALB水平明顯降低，至第4周降至最低，8周后有所上升，且低蛋白血癥一直持續(xù)到實驗結(jié)束，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。模型組小鼠血清TC水平顯著增加，第4周達到高峰，8周后有所下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見表 2-3。

表2 兩組小鼠血清ALB水平比較（g/L，±s）

表2 兩組小鼠血清ALB水平比較（g/L，±s）

注：與正常對照組相同時間點比較，*P＜0.05；ALB：血清白蛋白

組別正常對照組模型組鼠數(shù)6 6 4W 22.27±1.41 11.98±1.33*8W 22.65±1.49 12.78±1.47*12W 23.31±1.49 12.99±1.38*

表3 兩組小鼠血清TC水平比較（mmol/L，±s）

表3 兩組小鼠血清TC水平比較（mmol/L，±s）

注：與正常對照組相同時間點比較，*P＜0.05；TC：總膽固醇

組別正常對照組模型組鼠數(shù)6 6 4W 2.01±0.49 8.84±1.30*8W 2.06±0.49 7.45±1.27*12W 2.10±0.54 6.79±1.38*

3.3 腎臟病理改變 模型組小鼠腎臟組織第4周可見部分腎小球出現(xiàn)系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞輕度增生，伴有足細(xì)胞輕度腫脹；第8周部分腎小球出現(xiàn)系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞中度增生，伴有明顯的足細(xì)胞腫脹增殖，血管袢和腎小球囊粘連，腎小管可見大量蛋白管型，腎間質(zhì)有少許中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤；第12周彌漫性腎小球出現(xiàn)系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞重度增生，足細(xì)胞增生明顯，腎小管內(nèi)可見大量蛋白管型，部分腎小管萎縮，腎間質(zhì)小動脈管壁增厚、管腔狹窄，間質(zhì)少量纖維化。見插頁圖1-2。

3.4 兩組足細(xì)胞數(shù)量差異 WT1是足細(xì)胞胞核的特異性標(biāo)記，它通常用來計數(shù)足細(xì)胞的數(shù)量。隨著時間的進展，模型組小鼠足細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。4周末足細(xì)胞數(shù)量開始減少，12周末明顯減少。見封三圖3，見表 4。

表4 兩組小鼠足細(xì)胞計數(shù)（個/腎小球，±s）

表4 兩組小鼠足細(xì)胞計數(shù)（個/腎小球，±s）

注：與正常對照組相同時間點比較，*P＜0.05

組別正常對照組模型組鼠數(shù)6 6 4W 104.00±10.05 77.40±7.56*8W 103.80±12.23 63.27±8.51*12W 98.86±8.89 53.15±8.23*

3.5 實時熒光定 PCR檢測 Kindlin-2、Nephrin、Podocin mRNA相對表達量 模型組小鼠第4、8、12周腎組織Kindlin-2 mRNA水平明顯高于對照組（P＜0.05 或 P＜0.01）；模型組小鼠第 8、12 周腎組織Nephrin mRNA水平明顯低于對照組（P＜0.05或P＜0.01）；模型組小鼠第 4、8、12 周腎組織 Podocin mRNA水平明顯低于對照組（P＜0.05或 P＜0.01）。見表5。

3.6 Kindlin-2 mRNA水平與足細(xì)胞數(shù)量、Nephrin mRNA及Podocin mRNA水平相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析顯示，Kindlin-2 mRNA水平與足細(xì)胞數(shù)量（r=-0.02，P＜0.01）、Nephrin mRNA 水平（r=-0.8，P＜0.01）、Podocin mRNA 水平（r=-0.9，P＜0.01）呈顯著負(fù)相關(guān)。見封三圖4。

表5 Kindlin-2、Nephrin及Podocin mRNA相對表達量比較（±s）

表5 Kindlin-2、Nephrin及Podocin mRNA相對表達量比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；ADR-4W：阿霉素誘導(dǎo)后第4周；ADR-8W：阿霉素誘導(dǎo)后第8周；ADR-12W：阿霉素誘導(dǎo)后第12周

組別正常對照組ADR-4W組ADR-8W組ADR-12W組鼠數(shù)6 6 6 6 kindlin-2 0.82±0.07 1.14±0.06*1.13±0.08**1.45±0.10**Nephrin 2.06±0.20 1.56±0.15 1.42±0.13*1.17±0.11**Podocin 2.05±0.05 1.79±0.08*1.64±0.06**1.45±0.07**

4 討論

局灶節(jié)段性腎小球硬化癥（FSGS）是由不同病因?qū)е伦慵?xì)胞受到損傷，進一步引起相似腎小球病理改變的一組臨床病理綜合征。Kindlin家族是一類新發(fā)現(xiàn)的黏著斑蛋白，Kindlin不僅在參與了整合素的活化，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用，而且參與了細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的調(diào)控[9]。其中Kindlin-2廣泛表達于成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞。Kindhn-2的缺失不僅可以導(dǎo)致整合素信號通路異常，而且可以導(dǎo)致細(xì)胞黏附與細(xì)胞支架重組的嚴(yán)重缺陷[10]。已有研究[11]表明，Kindlin-2直接與ILK和migfilin結(jié)合，主要定位于細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附位點，Kindlin-2與migfilin的任何一個下調(diào)都能夠抑制細(xì)胞的延展。目前關(guān)于Kindlln-2在腎臟疾病的研究極少，Qu等[5]發(fā)現(xiàn)Kindlin-2通過與磷肌醇類、整合素的相互作用而調(diào)節(jié)足細(xì)胞粘附和纖維連接蛋白的沉積，提示Kindlin-2參與了腎小球疾病。Wei等[6]研究表明，在UUO（單側(cè)輸尿管梗阻）小鼠模型中，Kindlin-2表達顯著上調(diào)，敲低Kindlin-2可以有效減輕UUO小鼠的腎臟纖維化。局灶節(jié)段腎小球硬化癥是一種常見的腎臟足細(xì)胞病變，疾病發(fā)展終末期，可見明顯的腎臟纖維化，但是目前關(guān)于Kindlin-2在局灶節(jié)段腎小球硬化癥的作用研究未有報道，故研究Kindlin-2在局灶節(jié)段腎小球硬化癥中的作用具有重要意義。

進展性阿霉素腎病模型是經(jīng)典的FSGS動物模型。本實驗利用對腎毒性比較敏感的野生型BALB/C小鼠[12]，通過單次尾靜脈注射阿霉素建立經(jīng)典的局灶節(jié)段腎小球硬化癥-阿霉素腎病模型。注射阿霉素4周后，模型組小鼠就已經(jīng)表現(xiàn)為大量蛋白尿，低蛋白血癥及高膽固醇血癥，符合腎病綜合征的臨床表現(xiàn)。模型組第4周可見部分腎小球出現(xiàn)局灶、節(jié)段硬化，伴有足細(xì)胞腫脹；第8周部分腎小球出現(xiàn)球性硬化，伴有明顯的足細(xì)胞增生和肥大；第12周彌漫性腎小球出現(xiàn)球形硬化，符合FSGS的病理發(fā)展特點。WT1是成熟足細(xì)胞的特異性標(biāo)志之一，通常使用WT1免疫組化染色以計數(shù)足細(xì)胞數(shù)量。4周末模型組足細(xì)胞數(shù)量開始減少，且隨著時間的進展，減少的越顯著。模型組第4周開始，Kindlin-2 mRNA水平開始上調(diào)，且隨著時間進展，8、12周腎組織Kindlin-2 mRNA水平明顯高于對照組。推測Kindlin-2不僅參與了FSGS早期足細(xì)胞損傷的過程，且與FSGS中晚期腎小球硬化及間質(zhì)纖維化有密切關(guān)系，在FSGS整個發(fā)病過程中起到了重要作用。Nephrin、Podocin是足細(xì)胞裂孔膜上重要的跨膜糖蛋白，在腎小球濾過屏障的形成以及功能維持等方面起著重要作用。模型組第8、12周腎組織nephrin mRNA水平明顯低于對照組。模型組第4、8、12周腎組織Podocin mRNA水平明顯低于對照組。Kindlin-2mRNA水平與足細(xì)胞數(shù)量、Nephrin mRNA及Podocin mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明隨著FSGS疾病的進展，Kindlin-2mRNA的水平明顯增多，但足細(xì)胞的損傷卻日益嚴(yán)重。

本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)SGS小鼠模型Kindlin-2表達量逐漸增加，且Kindlin-2與足細(xì)胞相關(guān)蛋白WT1、Nephrin及Podocin呈現(xiàn)密切負(fù)相關(guān)，推測Kindlin-2可能通過介導(dǎo)足細(xì)胞損傷參與了局灶節(jié)段腎小球硬化癥小鼠發(fā)病過程，在臨床工作中通過檢測腎臟組織Kindlin-2表達可能有助于預(yù)后判斷，這將為FSGS的發(fā)病機制研究提供實驗依據(jù)，但具體機制有待進一步研究。