張 偉 涂敏芳 鄧煥華

(威海市中醫(yī)院，威海264200)

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞是一類新的CD4+T細(xì)胞亞群，它能夠特異性地產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-17[1，2]；而核孤兒受體-γt(ROR-γt)是它的特異性轉(zhuǎn)錄因子[3]，ROR-γt可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的產(chǎn)生及分化。IL-17具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞的作用。因此，Th17細(xì)胞介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞性哮喘氣道炎癥的發(fā)生[4]。本實(shí)驗(yàn)研究擬通過(guò)驗(yàn)證以下假說(shuō)來(lái)說(shuō)明中性粒細(xì)胞性哮喘氣道炎癥的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)與IL-6作為啟動(dòng)因子，促進(jìn)幼稚的CD4+T細(xì)胞通過(guò)JAK-STAT通路向Th17轉(zhuǎn)化，而ROR-γt是它的特異性轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)Th17的產(chǎn)生與分化，并分泌炎性因子IL-17，IL-17可招募大量的中性粒細(xì)胞，從而引發(fā)中性粒細(xì)胞性哮喘。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠24只，體重200～220 g,由蘇州工業(yè)園區(qū)愛(ài)爾麥特科技有限公司提供(合格證編號(hào)：No.201508901)，動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為江西中醫(yī)學(xué)院熱敏灸重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，室溫25℃，空氣濕度50%，通風(fēng)條件良好。

1.1.2主要試劑和儀器 10%卵白蛋白、脂多糖、TGF-β、IL-6、IL-17酶聯(lián)免疫試劑盒(Sigma公司生產(chǎn))；氫氧化鋁[Al(OH)3]溶液(廣州化學(xué)試劑廠)；FITC conjugated anti-CD4、PE-Cy7-conjugated anti-IL-17(eBioscience)；ROR-γt抗體、β-actin 抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；PCR引物(上海生工)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real time PCR mastermix(全式金生物技術(shù)有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；超聲霧化器(型號(hào)：402AI上海魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)：Multiskan mk3，芬蘭雷勃公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiDoc MP Bio-Rad公司)；分光光度儀(型號(hào)：Nano Drop 2000，Thermo Fisher Scientific公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：Micro 21R,Thermo Fisher Scientific公司)；多用途旋轉(zhuǎn)搖床(型號(hào)：QB-206，海門其林貝爾儀器制造有限公司)；Real time PCR儀(型號(hào)：ABI7500，Applied biosystems)；SDS-PAGE電泳儀(型號(hào)：PowerPac，Bio-Rad公司)；轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)：Trans-Blot Turbo，Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX，Beckman Coulter有限公司)；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：IX73，OLYMPUS公司)。

1.2方法

1.2.1分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組。每組8只。

1.2.2造模方法[5，6]模型組與地塞米松組于實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，2次致敏，每只大鼠用1%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，使其頸部豎直，用移液器取2 mg/kg脂多糖(LPS)經(jīng)鼻逐滴滴入，利用大鼠呼吸將致敏液吸入氣道，左右鼻孔交替進(jìn)行并于腹腔內(nèi)注入卵白蛋白(OVA)0.1 g/kg。從第15天開(kāi)始，用1%OVA溶液進(jìn)行霧化吸入激發(fā)，每天霧化30 min，霧化流量3 L/min，連續(xù)霧化2周。正常對(duì)照組于實(shí)驗(yàn)第1天和第8天腹腔注射注射用水0.2 ml，于實(shí)驗(yàn)第15天起開(kāi)始霧化吸入注射用水30 min，霧化流量3 L/min，連續(xù)霧化2周。

1.2.3造模成功標(biāo)準(zhǔn) 以大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、打噴嚏、呼吸頻率加快，幅度加大、腹式呼吸明顯和點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)重者呼吸減慢或節(jié)律不整，四肢癱軟，行動(dòng)遲滯或俯伏不動(dòng)，反應(yīng)遲鈍等癥狀為激發(fā)成功。

1.2.4地塞米松干預(yù)方法 于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第15天起，按0.5 mg/kg予以腹腔注射，每日一次，共14次，每次注射于OVA霧化吸入前0.5 h結(jié)束。

1.2.5樣品采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.2.5.1HE染色觀察肺組織病理形態(tài)學(xué) 取右肺上葉，石蠟包埋，HE染色，觀察肺泡壁厚度、肺泡大小及融合程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況、黏膜上皮纖維化情況、支氣管平滑肌細(xì)胞增生情況等。

1.2.5.2BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及ELISA法測(cè)TGF-β、IL-6、IL-17含量。BALF液采集方法：用動(dòng)脈鉗夾住右肺門，分離頸部氣管，于近氣管開(kāi)叉處行T型切口，插管至左支氣管下端分叉處，結(jié)扎氣管插管處。注射器吸取室溫生理鹽水0.5 ml，左肺變得膨隆、蒼白，回抽灌洗液，反復(fù)2次，收至離心管。重復(fù)采集3次，4℃下1 500 r/min離心，取上清，-20℃保存，做ELISA?；厥针x心后的細(xì)胞沉淀，加0.2 ml紅細(xì)胞裂解液，4℃下1 500 r/min離心，棄上清，加1 ml PBS重懸細(xì)胞，少量于Neubauer計(jì)數(shù)臺(tái)上做細(xì)胞總計(jì)數(shù)，一般以109L-1表示；剩余懸液注入液基細(xì)胞沉降管，經(jīng)安必平液基細(xì)胞沉降式制片、瑞氏染色，計(jì)200個(gè)細(xì)胞做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.2.5.3流式細(xì)胞術(shù)測(cè)外周血及脾臟中Th17的水平 各組大鼠于第28天霧化吸入結(jié)束后2 h內(nèi)取材。3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)行腹腔麻醉，剪開(kāi)大腿內(nèi)側(cè)肌肉暴露股動(dòng)脈，先用預(yù)先吸有肝素鈉1 ml的注射器經(jīng)股動(dòng)脈取血2 ml，作為流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)備用，股動(dòng)脈放血處死大鼠。打開(kāi)胸腔與腹腔，取脾臟。

流式細(xì)胞術(shù)：取新鮮脾及外周血，制備脾(外周血)淋巴細(xì)胞懸液，加入1×cell stimulation cocktail刺激淋巴細(xì)胞增殖，加入CD4+FITC、IL-17熒光單克隆抗體，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17所代表的Th17的含量。采用Flowjo分析軟件。

1.2.5.4免疫組織化學(xué)法測(cè)定大鼠肺組織中ROR-γt蛋白表達(dá) 取右肺中葉，石蠟包埋，脫蠟，水化，封片，一抗孵育，顯色，復(fù)染與封片。每個(gè)樣本隨機(jī)抽取3張免疫組化切片，每張切片在顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)互不重疊視野，測(cè)定單位面積陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的平均吸光度值。采用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.5.5免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)肺組織中ROR-γt蛋白含量 取右肺下葉組織，肺組織在RIPA蛋白裂解液中裂解，提取蛋白樣品，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗、二抗孵育，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)轉(zhuǎn)印膜上靶蛋白信號(hào)。采用Image-Pro Plus分析軟件進(jìn)行分析。

1.2.5.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肺組織中ROR-γt mRNA的表達(dá) 取右肺下葉組織，TRIzol法抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR擴(kuò)增，電泳(見(jiàn)表1)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠肺組織病理改變 在光鏡200 μm水平下觀察：正常對(duì)照組顯示細(xì)支氣管管壁光滑，支氣管平滑肌細(xì)胞未見(jiàn)增生，支氣管黏膜皺壁無(wú)增生，管腔通暢，管內(nèi)無(wú)炎性滲出物，肺泡壁厚薄均勻一致，肺泡大小均勻一致，肺泡無(wú)融合，杯狀細(xì)胞無(wú)增生，氣道、肺間質(zhì)、小血管內(nèi)無(wú)明顯炎性細(xì)胞；模型組氣管管壁周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主；支氣管黏膜皺裳增多延長(zhǎng)，杯狀細(xì)胞增生明顯，平滑肌增厚，管腔縮窄，內(nèi)有黏液栓，部分肺泡壁變薄或斷裂，融合成肺氣腫；地塞米松組氣管管壁周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管黏膜皺裳少許增多延長(zhǎng)，杯狀細(xì)胞少量增生，平滑肌輕度增厚，管腔稍有縮窄，內(nèi)有少量黏液栓，少量肺泡壁變薄或斷裂，融合成肺氣腫。見(jiàn)圖1。

2.2BALF中白細(xì)胞總數(shù)，炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 各組大鼠BALF溶液回收率>80%，與正常對(duì)照組比，模型組中BALF白細(xì)胞總數(shù)顯著增多(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比與正常對(duì)照組比較均顯著增多(P<0.01)，說(shuō)明中性粒細(xì)胞性哮喘肺內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。地塞米松組與模型組比較，白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比均顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明地塞米松對(duì)于控制哮喘炎性反應(yīng)具有顯著療效(圖2～4)。

表1目的基因的引物序列

Tab.1Primersequencesoftargetgene

PrimernamePrimersequencesAmplifiedfragment lengthROR-γtF:GCAGGAGCAATGGAAGTCG162 bpR:CGCTGAGGAAGTGGGAAAAβ-actinF:TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT220 bpR:CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC

2.3各組BALF液中TGF-β、IL-6、IL-17含量 模型組BALF中TGF-β、IL-6、IL-17的含量與正常對(duì)照組比較，顯著升高(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明中性粒細(xì)胞性哮喘大鼠支氣管、肺泡中有大量的TGF-β、IL-6、IL-17炎性因子，而地塞米松可顯著控制炎性因子的含量(表2、圖5)。

圖1 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理改變Fig.1 Observe pathological changes of lung tissues in each group though HE stain

圖2 各組大鼠BALF白細(xì)胞總計(jì)數(shù)Fig.2 Total count of WBC in BALF of each group Note:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

圖3 各組大鼠BALF中炎性細(xì)胞分類百分比Fig.3 Percentage of inflammatory cell classification in BALF of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

圖4 各組大鼠BALF炎性細(xì)胞分類計(jì)數(shù)(瑞氏染色)Fig.4 Inflammatory cell classification in BALF of each group(Wright′s tain)

表2各組大鼠BALF中TGF-β、IL-6、IL-17的含量比較

Tab.2ContentofTGF-β，IL-6，IL-17inBALFofeachgroup

GroupsTGF-β(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-17(pg/ml)Normal group41.16±10.1346.52±10.7552.54±12.34Model group101.47±23.361)113.73±25.421)167.58±38.941)Dex group77.81±18.541)2)82.56±19.411)2)103.85±23.451)2)

Note：1)P<0.01,vs normal group;2)P<0.01,vs model group.

圖5 各組大鼠BALF中TGF-β、IL-6、IL-17含量的比較Fig.5 Content of TGF-β，IL-6，IL-17 in BALF of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group；##.P<0.01,vs model group.

圖6 各組大鼠脾臟Th17的含量Fig.6 Content of Th17 in spleen of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group；##.P<0.01,vs model group.

圖7 各組大鼠外周血Th17的含量Fig.7 Content of Th17 in peripheral blood of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;▲.P<0.05,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

2.4各組大鼠脾臟及外周血中Th17的含量 以IL-17含量來(lái)代表的Th17在脾臟及外周血的含量，模型組Th17所占百分比顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而地塞米松組顯著高于或高于正常對(duì)照組(P<0.01或P<0.05)，而地塞米松組Th17含量與模型組比較則顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明中性粒細(xì)胞性哮喘大鼠幼稚的CD4+顯著向Th17分化，而地塞米松可顯著抑制Th0向Th17的分化(圖6、7)。

圖8各組大鼠肺組織ROR-γt蛋白的平均吸光度值

Fig.8AverageopticaldensityofROR-γtproteininlungtissueofeachgroup

Note: ▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

圖9 各組大鼠肺組織中ROR-γt蛋白表達(dá)的比較Fig.9 Relative expression level of ROR-γt protein in lung tissue of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

2.5各組大鼠肺組織中ROR-γt蛋白的含量 免疫組化法測(cè)得各組大鼠肺組織中ROR-γt平均吸光度值，模型組與地塞米松組皆顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，ROR-γt蛋白含量顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明ROR-γt參與了中性粒細(xì)胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制ROR-γt蛋白的水平，從而減輕中性粒細(xì)胞性哮喘的程度(圖8)。

圖10 各組大鼠肺組織中ROR-γt mRNA的表達(dá)Fig.10 Relative expression level of ROR-γt mRNA in lung tissue of each groupNote:▲▲.P<0.01,vs normal group;##.P<0.01,vs model group.

2.6肺組織中ROR-γt蛋白的免疫印跡表達(dá) Western blot法測(cè)得各組大鼠肺組織中ROR-γt蛋白的免疫印跡表達(dá)水平，模型組與地塞米松組ROR-γt蛋白表達(dá)皆顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，而地塞米松組與模型組比較，ROR-γt蛋白含量顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明ROR-γt參與了中性粒細(xì)胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制ROR-γt蛋白的水平，從而減輕中性粒細(xì)胞性哮喘的程度(圖9)。

2.7肺組織中ROR-γt mRNA的表達(dá) RT-PCR法測(cè)得各組大鼠肺組織中ROR-γt mRNA的表達(dá)水平，與正常對(duì)照組比較，模型組與地塞米松組ROR-γt mRNA表達(dá)量均顯著增高(P<0.01)，而與模型組比較，地塞米松組ROR-γt mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明ROR-γt參與了中性粒細(xì)胞性哮喘的發(fā)作，而地塞米松可以抑制ROR-γt蛋白的水平，從而減輕中性粒細(xì)胞性哮喘的程度(圖10)。

3 討論

Th17目前已證實(shí)是由天然T細(xì)胞前體Th0分化而來(lái)。Th0在特定抗原刺激及多種信號(hào)綜合作用下，活化后可以分化為不同的T輔助細(xì)胞亞群[7，8]。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)和IL-6共同作用下誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，分泌IL-17，并表達(dá)ROR-γt[9]，ROR-γt是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。ROR-γt是維甲酸相關(guān)核孤兒受體家族成員之一[10]，特異性分布于CD4+CD8+淋巴細(xì)胞[11]，受STAT3的調(diào)控[12]。ROR-γt可以作為染色體重塑因子開(kāi)放IL-17基因座位，并使其他因子直接結(jié)合到IL-17啟動(dòng)子上，從而誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞中IL-17基因的轉(zhuǎn)錄。在分化成熟的Th17細(xì)胞內(nèi)ROR-γt特異性高表達(dá)，而且在初始T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入編碼ROR-γt的逆轉(zhuǎn)錄病毒可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Th17，分泌IL-17；當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt缺陷時(shí)，炎癥細(xì)胞向組織的募集和浸潤(rùn)降低，自身免疫性疾病和炎癥性疾病的癥狀緩解[13]。IL-17是Th17的分泌因子[14]。IL-17是一種前炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)[15]。IL-17有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞因子的作用，并抑制Th2型嗜酸性細(xì)胞炎性反應(yīng)。

綜上所述，在ROR-γt特異性高表達(dá)下，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th17轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生大量的IL-17，而IL-17有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞因子的作用，產(chǎn)生了中性粒細(xì)胞參與為主的中性粒細(xì)胞型哮喘，而中性粒細(xì)胞參與了哮喘的急性發(fā)病及惡化過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，中性粒細(xì)胞性哮喘的氣道內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要以中性粒細(xì)胞為主，而地塞米松可顯著減少炎性細(xì)胞的數(shù)量，從而減輕哮喘的發(fā)作。TGF-β、IL-6和IL-17在BALF中大量存在，TGF-β、IL-6有可能為Th17介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞性哮喘的啟動(dòng)因子，而IL-17則為下游因子，它可以募集大量的中性粒細(xì)胞，引發(fā)急性哮喘的發(fā)作；經(jīng)地塞米松治療后，TGF-β、IL-6和IL-17在BALF中的含量則顯著降低。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定，在脾臟與外周血中可檢測(cè)到Th17的存在，且模型組的含量顯著高于正常組與地塞米松組，說(shuō)明中性粒細(xì)胞性哮喘與Th17的升高有高度相關(guān)性；在肺組織中，通過(guò)免疫組化法及免疫印跡法測(cè)得ROR-γt蛋白的表達(dá)，RT-PCR法測(cè)得ROR-γtmRNA的表達(dá)，ROR-γt在中性粒細(xì)胞性哮喘模型中均有高表達(dá)，而地塞米松可顯著降低ROR-γt的含量，說(shuō)明ROR-γt參與了Th17細(xì)胞的分化過(guò)程，并且是促進(jìn)Th0向Th17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

因此，中性粒細(xì)胞性哮喘與Th17高表達(dá)密切相關(guān)，而ROR-γt是促進(jìn)Th0向Th17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Th17產(chǎn)生大量的IL-17，而IL-17具有強(qiáng)大的募集中性粒細(xì)胞的作用，從而使氣道內(nèi)產(chǎn)生大量的炎性因子，并引發(fā)中性粒細(xì)胞性哮喘的發(fā)生。