溫 輝 薛敬玲

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 武漢 430071)

結(jié)腸直腸癌，一種最常見的起源于上皮細(xì)胞的上皮癌，是工業(yè)化國(guó)家癌癥相關(guān)死亡率的主要原因，在西方國(guó)家結(jié)腸癌占惡性腫瘤死因的第3位[1]。在我國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)直腸癌發(fā)病率為29.44/105，死亡率為14.23/105，且其發(fā)病率與死亡率呈逐步上升的趨勢(shì)[2]。Morson等研究者提出了腺瘤-癌演變學(xué)說(shuō)[3]，認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生起源于腺瘤的癌變，結(jié)直腸腺瘤屬癌前期病變，上皮細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，逐漸形成腺瘤性息肉組織，最終形成惡性腫瘤組織。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)是導(dǎo)致其治療失敗和患者死亡的主要原因，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是許多腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移早期的一個(gè)重要的過(guò)程[4]，其中多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與 EMT 的調(diào)節(jié)。

Twist1是一種堿性螺旋狀的轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，還可明顯促進(jìn)腫瘤出現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移等病理現(xiàn)象[5]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)則是具有多種生理學(xué)功能的多肽類生長(zhǎng)因子，可有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞間基質(zhì)的形成，與腫瘤疾病發(fā)生、發(fā)展存在密切的聯(lián)系[6]。上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種鈣黏蛋白，其表達(dá)水平降低可導(dǎo)致上皮細(xì)胞之間的黏附能力明顯喪失、極性消失，使得腫瘤細(xì)胞遷移能力顯著性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移等[7]。本研究擬檢測(cè)E-cadherin、TGF-β1和Twist1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院2016年1月～2017年12月間手術(shù)切除、病理證實(shí)為結(jié)直腸癌(腺癌) 的標(biāo)本70例，其中男性45例，女性25例，年齡18～80 歲，組織病理學(xué)確定病理類型、分化程度、浸潤(rùn)深度、微浸潤(rùn)情況及有無(wú)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織分化程度:高、中、低分化分別36、20、14例；浸潤(rùn)深度: 至或者穿透漿膜層的42 例，到達(dá)肌層的28 例；有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的26 例，無(wú)轉(zhuǎn)移的44例；30 例癌旁正常組織取自距腫瘤邊緣5 cm 以上黏膜；結(jié)直腸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變60例，結(jié)直腸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變60例。

1.2 研究方法

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達(dá)水平，將所有切除后新鮮標(biāo)本固定在10%中性緩沖甲醛固定液中，取出標(biāo)本，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟后，切片，片厚3μm，測(cè)定時(shí)進(jìn)行二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化，3%過(guò)氧化氫浸泡10min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，檸檬酸緩沖液( pH 6.0±0.1)高溫修復(fù)抗原；使用一抗分別為:兔抗人TGF-β1單克隆抗體(購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，工作液濃度為1∶200) 、兔抗人Twist1多克隆抗體(購(gòu)自上海愛必信生物技術(shù)有限公司，工作液濃度為1∶1600) 、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(購(gòu)自福州邁新生物有限公司, 即用型),使用二抗是即用型免疫組化EliVision檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自福州邁新生物有限公司)。采用EnVision二步法：滴加一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜；滴加二抗，37°C孵育30min;各步驟間均以0.01 mol /L PBS 緩沖液沖洗，嚴(yán)格按照說(shuō)明控制時(shí)間和溫度;DAB顯色、蘇木素輕微襯染、脫水、透明、中性樹膠封片，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，顯微鏡觀察。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

E-cadherin和TGF-β1按Shimizu[8]方法對(duì)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的著色程度進(jìn)行分析，分為著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色，分別計(jì)為0、1、2、3分，著色陽(yáng)性面積按無(wú)著色、著色面積<1/3、1/3～2/3、>2/3分別計(jì)0、1、2和3分，根據(jù)著色程度和著色面積積分之和判斷最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果：≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取其平均值。Twist1主要表達(dá)于細(xì)胞核，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比例將染色結(jié)果分為陽(yáng)性與陰性[9]:即陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0～10%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%為陽(yáng)性，所有切片由兩名具有豐富閱片經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師以雙盲法予以判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件包對(duì)全部資料予以分析處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用非參數(shù)Spearman等級(jí)進(jìn)行相關(guān)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1陽(yáng)性率比較

E-cadherin、TGF-β1和Twist1蛋白在不同組織中的表達(dá)結(jié)果見圖1。免疫組化結(jié)果顯示了3種蛋白在癌組織中的定位:E-cadherin在正常細(xì)胞主要定位于細(xì)胞膜，而在腫瘤細(xì)胞定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)， TGF-β1定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而Twist1表達(dá)定位主要存在于癌細(xì)胞細(xì)胞核中，部分細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)。

圖1 結(jié)直腸癌組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、癌旁組織中E-cadherin、TGF-β1和Twist1蛋白表達(dá)差異(免疫組化SP×200)

免疫組化結(jié)果顯示各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1陽(yáng)性率比較均有顯著性差異(P<0.05)，且隨著結(jié)直腸癌組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、癌旁組織，E-cadherin陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)，而TGF-β1和Twist1陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.2 結(jié)直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達(dá)在分化程度、Duke分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面均存在顯著性差異(P<0.05)，而在性別、年齡等方面無(wú)明顯差異(P>0.05)，見表2。

2.3 結(jié)直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達(dá)之間的相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌E-cadherin與TGF-β1、Twist1均呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系(r=-0.632，-0.584，P<0.05)，TGF-β1與Twist1呈正相關(guān)性關(guān)系(r=0.617，P<0.05)。

表1 各組E-cadherin、TGF-β1和Twist1陽(yáng)性率比較(%)

組別例數(shù)Cadherin陽(yáng)性率TGF-β1陽(yáng)性率Twist1陽(yáng)性率結(jié)直腸癌組織7042.86(30/70)85.71(60/70)80.0(56/70)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織6061.67(37/60)*68.33(41/60)*63.33(38/60)*低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織6075.0(45/60)*#50.0(30/60)*#45.0(27/60)*#癌旁組織30 90.0(27/30)*#▲33.33(10/30)*#▲30.0(9/30)*#▲

注：*與結(jié)直腸癌組織比較，P<0.05；#癌旁組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織比較，P<0.05；▲癌旁組織與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織比較，P<0.05。

表2 結(jié)直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

組別例數(shù)E-cadherin陽(yáng)性率(%)TGF-β1陽(yáng)性率(%)Twist1陽(yáng)性率(%)P值性別男4542.22(19/45)86.67(39/45)82.22(37/45)女25 44.0(11/25)84.0(21/25)76.0(19/25)P>0.05年齡≤50歲2240.91(9/22)86.36(19/22)81.82(18/22)>50歲4843.75(21/48)85.42(41/48)79.17(38/48)P>0.05分化程度高3655.56(20/36)77.78(28/36)69.44(25/36)中2040.0(8/20)90.0(18/20)85.0(17/20)低1414.29(2/14)100.0(14/14)100.0(14/14)P<0.05Duke分期A1070.0(7/10)70.0(7/10)70.0(7/10)B2850.0(14/28)82.14(23/28)71.43(20/28)C2035.0(7/20)90.0(18/20)85.0(17/20)D1214.29(2/12)100.0(12/12)100.0(12/12)P<0.05浸潤(rùn)深度至或出漿膜4235.71(15/42)92.86(39/42)88.10(37/42)肌層2853.57(15/28)75.0(21/28)67.86(19/28)P<0.05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有2630.77(8/26)96.16(25/26)92.31(24/26)無(wú)4450.0(22/44)79.55(35/44)72.73(32/44)P<0.05

3 討論

E-cadherin是鈣黏蛋白家族成員之一，是一類Ca依賴的糖蛋白，在上皮細(xì)胞中起著維持細(xì)胞極性及黏附力的作用，維持正常組織和器官的結(jié)構(gòu)和功能，EMT過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)上皮性標(biāo)記物喪失，最典型就是E-cadherin蛋白的丟失，導(dǎo)致上皮細(xì)胞之間的黏附力喪失、極性消失，使細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。Twist1為在果蠅、鼠、人等生物體內(nèi)的一種堿性螺旋轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于胎盤、胚胎中胚層和成人的某些中胚層來(lái)源的未分化組織。最近研究發(fā)現(xiàn)，Twist1具有癌基因的特征，能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，參與腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控，并通過(guò)調(diào)解腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等參與了惡性腫瘤的發(fā)生，并且促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[11]。Valdés-Mora等[5]使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了54例結(jié)直腸癌及其癌旁正常黏膜Twist1的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌Twist1的mRNA表達(dá)顯著高于正常黏膜組織表達(dá), 并且其表達(dá)還與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)，提示Twist1是結(jié)直腸癌演進(jìn)過(guò)程中一個(gè)重要因子。TGF-β1是一類具有多種功能的多肽類生長(zhǎng)因子，主要功能是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)基質(zhì)形成，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其以自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生，生物學(xué)作用多樣，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)形成及刺激細(xì)胞外基質(zhì)分泌、抑制免疫反應(yīng)等[12, 13]。研究認(rèn)為[1]，TGF-β1 作為 EMT 發(fā)生的一個(gè)主要誘導(dǎo)劑，與E-cadherin的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列E-box結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，通過(guò)改變細(xì)胞形態(tài)變化、上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記(vimentin、fibronectin)表達(dá)及下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)記 E-cadherin表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT，而Twist1作為TGF-β1 信號(hào)途徑的下游信號(hào)因子，我們推測(cè)TGF-β1可能是通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活Twist1的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)EMT標(biāo)記蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 Fan等[14]對(duì)193 例結(jié)直腸癌患者組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Twist1的異位表達(dá)可降低E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)EMT產(chǎn)生，從而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)，結(jié)合前面的實(shí)驗(yàn)，隨著結(jié)直腸癌組織、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織、癌旁組織，E-cadherin陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)，而TGF-β1和Twist1陽(yáng)性率明顯降低(P<0.05)，這表明Twist1、TGF-β1 的高表達(dá)以及E-cadherin的低表達(dá)在誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮一定作用，這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可為我們后期探討結(jié)直腸癌癌變的分子機(jī)制提供必要的理論基礎(chǔ)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌E-cadherin、TGF-β1和Twist1表達(dá)在分化程度、Duke分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面均存在顯著性差異(P<0.05)，且結(jié)直腸癌E-cadherin與TGF-β1、Twist1均呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，TGF-β1與Twist1呈正相關(guān)性關(guān)系(P<0.05)，這與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10,13]。綜上所述，E-cadherin、TGF-β1和Twist1三者與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)行為密切相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸組織E-cadherin、TGF-β1和Twist1的表達(dá)有可能為判斷結(jié)直腸癌的惡性程度及患者的預(yù)后提供線索并且有助于早期診斷結(jié)直腸癌和指導(dǎo)臨床治療。