張 媛 ，賀桂芳 ，馬 莉 ，趙婷婷 ，卞美璐 ，原亞莉 ，楊文艷

（1.北京大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，北京 100191；2.北京大學(xué) 中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029；4.中日友好臨床研究所 “免疫炎性疾病”北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

宮頸癌發(fā)病率在全球女性腫瘤中位居第三位，在發(fā)展中國(guó)家位居第二位[1，2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）估算，全球每年約53萬(wàn)女性發(fā)生宮頸癌，約27.5萬(wàn)女性死于宮頸癌。宮頸癌在多數(shù)發(fā)展中國(guó)家，占女性腫瘤死因的第一位[3]。我國(guó)宮頸癌每年新發(fā)病例約為9.6萬(wàn)例，占世界宮頸癌每年新發(fā)病例的18%，其中死亡病例約2.6萬(wàn)[4]。在基線為CINⅠ的患者，p16INK4a陽(yáng)性與陰性婦女相比，2年后進(jìn)展為高級(jí)別子宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)前者是后者8.25倍，表明p16INK4a的過(guò)度表達(dá)與宮頸病變程度相關(guān)，低級(jí)別宮頸病變組織中p16INK4a過(guò)度表達(dá)能夠?qū)ζ湟院筮M(jìn)展為高級(jí)別宮頸病變具有預(yù)測(cè)能力[5]。對(duì)于CINⅡ具有進(jìn)展和退化的生物學(xué)行為，目前我國(guó)尚缺乏確切的方法判斷其預(yù)后轉(zhuǎn)歸。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)P16表達(dá)情況，分析P16蛋白表達(dá)與CINⅡ病變進(jìn)展的關(guān)系，為臨床采用合理的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

選取2008年1月～2017年12月就診于中日友好醫(yī)院，經(jīng)術(shù)后病理報(bào)告確診為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CINⅡ）患者的石蠟組織切片158例。正常宮頸石蠟組織切片40例?；颊呓M織的病理診斷均經(jīng)2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師確診。

1.2 試劑

抗P16（E6H4）鼠單克隆抗體試劑、新型酶標(biāo)記物IgG聚合物（上海羅氏制藥有限公司）。二氮基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。采用Tris-HCl緩沖液來(lái)稀釋抗P16（E6H4）鼠單克隆抗體試劑。在此產(chǎn)品中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已知的非特異性抗體反應(yīng)性。

1.3 檢測(cè)方法

利用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行染色。結(jié)果判定：P16INK4A的免疫組織化學(xué)判定方法主要有兩個(gè)方面：表達(dá)強(qiáng)度和細(xì)胞中表達(dá)部位。陽(yáng)性結(jié)果為黃色或棕黃色染色，表達(dá)部位是在胞漿和/或細(xì)胞核。表達(dá)強(qiáng)度參照KLEASR等[6]的半定量標(biāo)準(zhǔn)，按照陽(yáng)性細(xì)胞核所占比例及分布情況記錄如下：陰性（-）：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%；弱陽(yáng)性（+）：散在的或小的細(xì)胞團(tuán)染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5%-24%；陽(yáng)性（++）：片狀或簇狀細(xì)胞染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)位25%-50%；強(qiáng)陽(yáng)性：彌漫散的細(xì)胞染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50%。

HPV檢測(cè)：采用免疫組化技術(shù)法，通過(guò)發(fā)光放大微孔板中基因信號(hào)，對(duì)受檢標(biāo)本中HPV18，33，45等13種高危型HPV病毒進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果陰性：HPV-DNA負(fù)荷量＜1.0pg/ml；陽(yáng)性：HPV-DNA負(fù)荷量≥1.0pg/ml；其中HPVDNA負(fù)荷量=標(biāo)本相對(duì)發(fā)光單位/標(biāo)本陽(yáng)性對(duì)照。

LCT檢測(cè)：清潔宮頸表面黏液，將特制的宮頸細(xì)胞刷插入宮頸管內(nèi)，順時(shí)針在宮頸內(nèi)旋轉(zhuǎn)5周后快速取出，注入細(xì)胞保存液中獲取細(xì)胞樣品，采用TBS系統(tǒng)檢測(cè)液基細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性：ASCH、AGUS/ASCUS、HSIL、LSIL 出現(xiàn)異常或病變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析比較患者的術(shù)后隨訪細(xì)胞學(xué)結(jié)果和P16的表達(dá)關(guān)系，再用秩和檢驗(yàn)來(lái)比較各組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 宮頸標(biāo)本中P16生物標(biāo)記物表達(dá)情況

宮頸標(biāo)本中P16生物標(biāo)記物過(guò)度表達(dá)表現(xiàn)為宮頸鱗狀上皮的基底層和基底旁層細(xì)胞的彌漫性連續(xù)性染色、伴有或不伴有淺表細(xì)胞層細(xì)胞染色，呈淡黃色至棕褐色，表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（見(jiàn)圖1，封底）。

圖1 A.CINⅡ患者P16陽(yáng)性表達(dá)。B.CINⅡ患者P16陰性表達(dá)。（100×）

2.2 P16在正常組織與CINⅡ中陽(yáng)性表達(dá)

對(duì)40例正常宮頸組織和158例術(shù)后病理確診為CINⅡ患者的石蠟切片利用免疫組化原理進(jìn)行染色，觀察P16表達(dá)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。表1示，CINⅡ患者宮頸組織中P16陽(yáng)性表達(dá)率為55.7%，顯著高于正常宮頸組織中P16陽(yáng)性表達(dá)率（7.5%，P＜0.01）。

2.3 P16陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染的關(guān)系

對(duì)158例CINⅡ患者中進(jìn)行HPV感染與P16陽(yáng)性表達(dá)關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析。隨機(jī)挑選22例P16陰性的患者中HPV陰性表達(dá)為18例，陰性表達(dá)率為82%；HPV陽(yáng)性表達(dá)為4例，陽(yáng)性率18%。隨機(jī)挑選40例P16陽(yáng)性表達(dá)CINⅡ患者中進(jìn)行HPV感染的統(tǒng)計(jì)。HPV陰性表達(dá)為10例，陰性表達(dá)率為25%；HPV陽(yáng)性表達(dá)30例，陽(yáng)性率75%。P16陽(yáng)性表達(dá)與HPV陽(yáng)性和陰性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表 2）。

2.4 CINⅡ患者陽(yáng)性表達(dá)術(shù)后隨訪結(jié)果

表3示，在CINⅡ患者中隨機(jī)選取37例進(jìn)行術(shù)后隨訪，P16陽(yáng)性患者超薄細(xì)胞檢測(cè)（LCT）陽(yáng)性率72.72%，顯著高于P16陰性患者的LCT陽(yáng)性率（15.79%，P＜0.05）。

表1 P16在正常組織與CINⅡ中陽(yáng)性表達(dá)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果 n（%）

表2 P16陽(yáng)性表達(dá)與HPV感染的關(guān)系 n（%）

表3 CINⅡ患者P16陽(yáng)性表達(dá)術(shù)后隨訪結(jié)果 n（%）

3 討論

p16基因是一個(gè)多腫瘤抑制基因，主要作用在于能夠直接參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶CDK4／CDK6的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入s期[7]。p16基因的失活將導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞異常增殖而癌變。該基因產(chǎn)物對(duì)CDK4的活性具有抑制作用，因而也稱為p16 INK4（inhibitor of CDK4）[8]。 P16 的高表達(dá)與宮頸癌有一定的相關(guān)性，在組織病理學(xué)中這一結(jié)論已經(jīng)得到證實(shí)[9]。因此P16免疫組化染色已被應(yīng)用于宮頸癌前病變的輔助診斷，以提高診斷的準(zhǔn)確率和可重復(fù)性。

有關(guān)報(bào)道指出，P16在正常組織中表達(dá)率為2%，在CIN1中表達(dá)率為38%，在CIN2中表達(dá)率為68%，在CIN3中表達(dá)率為82%[10]。因此P16可以作為宮頸癌上皮內(nèi)瘤變的一個(gè)有效的分子指標(biāo)。本研究中，P16在正常宮頸組織中陽(yáng)性率為7.5%；在CINⅡ患者中陽(yáng)性率為55.7%。P16在正常組織和CINⅡ患者中陽(yáng)性表達(dá)情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。進(jìn)一步證實(shí)了CINⅡ患者中P16表達(dá)呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明P16的高表達(dá)促進(jìn)了宮頸病變的進(jìn)展。

1977年ZurHausen發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生的一個(gè)重要原因是HPV感染，研究表明由于HR-HPV的E7癌蛋白介導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白失活，P16蛋白強(qiáng)烈過(guò)度表達(dá)[11]。由于E7是HPV相關(guān)癌前病變和癌變中維持惡性表型的必要因素，因此P16過(guò)度表達(dá)與HR-HPV的致癌活性直接相關(guān)，并被認(rèn)為是HPV感染轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物。本研究中P16陽(yáng)性表達(dá)CINⅡ患者中HPV陽(yáng)性率為75%，陰性率為25%。P16陽(yáng)性表達(dá)與HPV是否感染，兩者差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了P16過(guò)度表達(dá)與HPV感染的致病有直接關(guān)系。

Roelens等對(duì)p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與人乳頭瘤病毒基因檢測(cè)HC-Ⅱ?qū)SCUS和LSIL的分流能力做了薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16INK4a預(yù)測(cè)ASCUS和LSIL進(jìn)展為高級(jí)別子宮頸病變的敏感度分別為83.2%、83.8%，特異度分別為71.0%、65.7%，與HC-Ⅱ相比，兩者的敏感度相近，但前者的特異度較高[12]。而我國(guó)目前對(duì)于宮頸病變存在過(guò)度診治的現(xiàn)象，尤其對(duì)CINⅡ的患者；P16對(duì)于CIN的診斷有極好的指導(dǎo)作用，可以減少宮頸病變的過(guò)度診治。P16陰性的患者術(shù)后隨訪超薄細(xì)胞檢測(cè)（LCT）陰性表達(dá)率為84.21%；陽(yáng)性表達(dá)率為15.79%。P16陽(yáng)性患者進(jìn)行術(shù)后隨訪超薄細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，陰性表達(dá)率為27.78%，陽(yáng)性表達(dá)率為72.22%。術(shù)后隨訪超薄細(xì)胞學(xué)檢查與P16陽(yáng)性和陰性表達(dá)兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。可見(jiàn)，P16陽(yáng)性患者術(shù)后病情持續(xù)和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)更高；P16陰性患者可以采取暫時(shí)觀察，以減少不必要的手術(shù)創(chuàng)傷。

因此，我們認(rèn)為在CINⅡ級(jí)別病變中，P16陽(yáng)性與陰性婦女對(duì)比，未來(lái)進(jìn)展為更高級(jí)別子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)明顯增加，因而P16蛋白可以作為有效的指標(biāo)指導(dǎo)CINⅡ級(jí)別病變的臨床治療。從而建議條件允許的情況下，陰道鏡同時(shí)行P16檢測(cè)，陰性表達(dá)患者進(jìn)行觀察治療，陽(yáng)性表達(dá)患者積極采取錐切治療，采取個(gè)體化分流措施以減少生育需求者的創(chuàng)傷。P16染色結(jié)果可作為CINⅡ病變轉(zhuǎn)歸結(jié)局的預(yù)警指標(biāo)，可用于CINⅡ患者隨訪的分流管理，優(yōu)化宮頸癌的篩查流程，對(duì)于CINⅡ患者干預(yù)或隨訪策略的制定具有指導(dǎo)意義。

4 參考文獻(xiàn)