劉紅，曾建勇，梁雪琪，鄧曉華，李震源

（1.中山市農(nóng)業(yè)科技推廣中心，廣東中山 528403）（2.中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，廣東中山 528400）

磺胺類抗生素(sulfonamides，sAs)是人工合成的具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥物[1]，喹諾酮類（4-quinolones）是一類含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥物[2]，兩類藥物都因具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、高效、低毒、價格低和使用方便等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用到養(yǎng)殖業(yè)上，用來治療和預(yù)防動物的疾病感染，并越來越受到養(yǎng)殖戶的重視。但由于生產(chǎn)者用藥不規(guī)范或不遵守正確的休藥期等因素，容易導(dǎo)致 sAs和 FQs（fluoroquinolones，氟喹諾酮類抗生素）在畜禽體內(nèi)過量積聚殘留，污染動物性食品，間接對人體產(chǎn)生危害，如過敏反應(yīng)、泌尿系統(tǒng)損害等，嚴重的可導(dǎo)致休克甚至死亡。某些藥物還存在潛在的致癌性，對人體產(chǎn)生持久危害。為此，世界各國對食品中的sAs和FQs的殘留限量提出了嚴格要求，而且許多國家將sAs和FQs列入抗生素禁用清單。目前，歐盟、美國、日本和韓國等國家均將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物，美國則禁止喹諾酮類藥物應(yīng)用于動物源性食品[3]，我國農(nóng)業(yè)部《獸藥停藥期規(guī)定》中也指出多種喹諾酮藥物制劑在產(chǎn)蛋雞中禁用，農(nóng)業(yè)部公告第235號對動物源性食品中使用磺胺類藥物的規(guī)定限量為總量不得大于100 μg/kg。

目前，國內(nèi)外對磺胺類藥物和喹諾酮類藥物殘留檢測研究比較常見，報道過的文獻也較多，但多數(shù)都是針對其中一類藥物的檢測分析研究，兩類藥物一起進行前處理檢測的并不多見。國內(nèi)外對sAs和FQs的分析檢測方法主要有微生物檢測法[4～6]、酶聯(lián)免疫吸附法[7,8]、毛細管電泳法(CE)[9,10]、高效液相色譜法（HPLC）[11～20]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[21～29]等，其中，HPLC-MS/MS 法是檢測動物源性食品中獸藥殘留的重要方法，這種方法結(jié)合液相保留時間，并采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，對特征離子進行定量和定性分析，適合于復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測。但目前檢測sAs和FQs的LC-MS/MS方法主要集中在水產(chǎn)品、雞肉、豬肉和牛奶等方面，未有文獻報道雞蛋中磺胺類藥物的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，可以同時檢測雞蛋中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的快捷方法更未見文獻報道。

在樣品前處理過程中，本實驗采用了創(chuàng)新型安捷倫增強型脂質(zhì)去除產(chǎn)品（QuEChERS EMR-Lipid）萃取技術(shù)凈化樣品。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，它是一種能夠選擇性去除復(fù)雜基質(zhì)中脂質(zhì)并挑戰(zhàn)鱷梨等高脂肪含量樣品的獨特吸附劑，可針對任意樣品前處理產(chǎn)品實現(xiàn)最徹底的脂質(zhì)去除和分析物回收，因此您可以在不損失分析物的前提下去除脂質(zhì)。此技術(shù)不僅提高了方法的靈敏度、精密度和回收率，而且其操作步驟也比較簡單，減少了操作過程中的各種誤差，樣品前處理的時間也大大縮短。

鑒于此，本文旨在建立一種新的高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法以檢測禽蛋中多種磺胺類藥物和多種氟喹諾酮類藥物的殘留含量，同時結(jié)合最新的 QuEChERS EMR-Lipid快速樣品提取技術(shù)進行樣品前處理。此方法不僅在結(jié)果上大大提高了藥物的檢測靈敏度，在樣品前處理上也適應(yīng)了快速、簡便、準確度高的優(yōu)點，適應(yīng)了食品安全檢測技術(shù)簡便快捷和自動化的發(fā)展趨勢。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PRIME-HLB 固相萃取柱（60 mg/3 cc），購自Waters公司；QuEChERS EMR-Lipid快速萃取，Agilent公司；標(biāo)準品磺胺噻唑(ST)、磺胺二甲異惡唑(SIZ)、磺胺多辛(SDM’)、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺(SN)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺吡啶(SPD)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺甲氧噠嗪(SMP)、磺胺嘧啶（SD）、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDM)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、麻保沙星、洛美沙星、培氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、二氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、吡哌酸、惡喹酸（奧索利酸）、依諾沙星（氟啶酸）、萘啶酸、氟甲喹、西諾沙星均為 Dr出品；乙腈、甲醇、甲酸(均為HPLC純試劑)，Merck公司；實驗用水為Watsons蒸餾水；檸檬酸、磷酸二氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等其余試劑均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；雞蛋樣品，中山市三鄉(xiāng)鎮(zhèn)白石雞場。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀G6495A LC-MSD QQQ(配有電噴霧離子源(ESI)及Masshunter B07.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國Agilent公司；全自動固相萃取儀，吉爾森公司；冷凍離心機3-30KS，德國Sigma公司；漩渦振蕩器，德國IKA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品提取凈化

準確稱取5.00 g（精確至0.01 g）雞蛋樣品，加入2%甲酸乙腈8 mL，漩渦震蕩1 min，再加入pH 7.0、0.1 mol/L的EDTA緩沖液0.5 mL，漩渦震蕩1 min，10000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管中（此管提前用pH 2.4、0.1 mol/L的乙酸銨溶液5 mL活化），劇烈震蕩1 min，10000 r/min離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至QuEChERS EMR-Lipid反萃取管中，劇烈震蕩1 min，10000 r/min離心3 min，吸取1 mL上清液到樣品瓶中，50 ℃下氮氣吹至近干。

1.3.2 上機測定

濃縮液用0.2%甲酸水：乙腈（4：1）定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm過濾膜轉(zhuǎn)移至進樣瓶中上機檢測。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：色譜柱：Agilent poroshell EC-C18柱，2.1 mm×100 mm，2.7 μm。

流動相：A相為0.2%甲酸溶液，B相為乙腈溶液；梯度洗脫程序見表1；進樣量：5.0 μL。

表1 流動相洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子掃描，動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dynamic MRM)，碰撞能量（Fragmentor）為380 V，霧化氣壓力（ion source gas 1，GS1）為50 psi，毛細管壓力（Capillary）為4000 V，干燥氣流速（Gas Flow）10 L/min，干燥氣溫度（Gas Temp）350 ℃，同時優(yōu)化各物質(zhì)的質(zhì)譜檢測參數(shù)（見表2）。

1.3.4 標(biāo)準溶液的配制與標(biāo)準曲線、檢測限與定量限測定

根據(jù)標(biāo)準品的實際含量換算標(biāo)準品的實際稱重量，分別準確稱取各標(biāo)準品，置于相應(yīng)容量瓶中，以10 mL水溶解，并用0.1%甲酸乙腈定容至刻度（其中惡喹酸10 mL水加1.5 mL氨水溶解，再用0.1%甲酸乙腈定容），即成100.00 μg/mL的標(biāo)準儲備液，4 ℃冰箱中避光保存。臨用前可將其用流動相稀釋至工作濃度標(biāo)準溶液。

配制一系列濃度的混標(biāo)溶液，用處理好的空白樣品基質(zhì)，配制0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL標(biāo)準工作溶液，上機檢測獲得基質(zhì)標(biāo)準曲線，數(shù)據(jù)處理獲得線性相關(guān)系數(shù)。

按3倍信噪比計算方法檢測限，10倍信噪比計算方法定量限。

1.3.5 添加回收率、精密度測定

準確稱取5.00 g（精確至0.01 g）雞蛋樣品，分別添加標(biāo)準溶液混合溶液8、16、32 μg/kg濃度，每個添加濃度做6個平行樣品，按上述方法進行處理分析，計算回收率和相對標(biāo)準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

圖1 不同色譜柱的選擇性離子流圖Fig.1 Selective ion flow diagrams of different chromatographic columns

注：X軸為生成時間（m），Y軸為峰高。a.Agilent poroshell SB-C18; b.Agilent poroshell EC-C18; c.Agilent poroshell Phenyl Hexyl

配制 0.1 mg/L的標(biāo)準溶液混合溶液，分別使用Agilent poroshell EC-C18柱(2.1 mm×100 mm，2.7μm)、Agilent poroshell SB-C18(2.1 mm×100 mm，2.7μm)和 Agilent poroshell Phenyl Hexyl(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)柱檢測，相同色譜質(zhì)譜條件下，Agilent poroshell EC-C18柱的響應(yīng)值和多種藥物成分的分離度都比Agilent poroshell SB-C18和Agilent poroshell Phenyl Hexyl的表現(xiàn)好(見圖1)，所以在以后的試驗中，我們選擇Agilent poroshell EC -C18柱。

2.2 質(zhì)譜條件選擇

圖2 30種抗生素的TIC圖Fig.2 Total ion chromatograms of 30 antibiotics

磺胺類藥物是人工合成的氨苯磺胺衍生物，基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為對氨基苯磺酰胺，喹諾酮類藥物則都是具有吡啶酮酸共同結(jié)構(gòu)的一組藥物，根據(jù)兩類藥物的分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)，我們選擇ESI（+）作為電離模式。采用直接進樣方式，0.1 mg/L單標(biāo)溶液進樣5.0 μL，正離子掃描模式對各藥物進行全掃描，選擇響應(yīng)最佳的準分子離子峰為母離子（parent ion，PI），再對母離子進行二級質(zhì)譜掃描，得到各個化合物響應(yīng)值最佳的碎片子離子（daughter ions，DI）。最后再對得到的每種藥物的二級質(zhì)譜的碰撞能量（CE）、電噴霧電壓（IS）、霧化氣、噴霧壓力、毛細管溫度和電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，從而使每種藥物的分子離子與特征離子碎片產(chǎn)生的離子強度達到最大時為最佳，使化合物的響應(yīng)最高（見表2）。在此條件下，各種藥物可以得到有效的分離（見圖2）。

2.3 色譜條件選擇

磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的結(jié)構(gòu)對pH值都有嚴格的要求。實驗比較了 0.2%甲酸-乙腈溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%甲酸-2 mmoL乙酸銨緩沖液-乙腈溶液、0.1%甲酸-0.05%氨水溶液-乙腈溶液對離子化的影響。結(jié)果表明，0.2%甲酸-乙腈溶液體系能使磺胺類藥物和喹諾酮類藥物在質(zhì)譜中有更好的響應(yīng)值，這是由于甲酸可以為陽離子的形成提供必需的質(zhì)子來源，從而提高其離子化效率。而乙酸銨緩沖液、0.1%甲酸乙腈溶液有明顯的拖尾現(xiàn)象，而且響應(yīng)值低，因此選用 0.2%甲酸-乙腈溶液作為流動相體系。此外，由于柱溫太低時流動相粘度大、色譜柱的理論塔板數(shù)低、目標(biāo)物質(zhì)出峰慢，因此柱溫選為40 ℃。

2.4 樣品前處理的優(yōu)化

磺胺類藥物和喹諾酮類藥物都含有較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，微溶于水和甲醇等有機溶液，尤其是在酸性環(huán)境下穩(wěn)定。本實驗比較了乙腈、0.1%甲酸乙腈溶液、0.2%甲酸乙腈溶液、0.5%甲酸乙腈溶液、1%甲酸乙腈溶液、2%甲酸乙腈溶液作為提取液提取樣品，發(fā)現(xiàn)用2%甲酸乙腈溶液提取樣品所得的提取液最清，蛋白除去效果最好，磺胺藥物的提取效果也較好，所以選擇 2%甲酸乙腈溶液作為提取液。喹諾酮類含有吡啶酮酸基本結(jié)構(gòu)，其羧基和酮基極易和金屬離子形成絡(luò)合物，所以單純 2%甲酸乙腈溶液提取時，喹諾酮類藥物的回收率幾乎沒有，所有我們在樣品提取過程中加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)去絡(luò)合提取管中的金屬離子，從而提高喹諾酮類藥物的回收率。比較了pH 7.0的0.1 mol/L EDTA、0.2 mol/L EDTA、0.5 mol/L EDTA、1 mol/L EDTA的絡(luò)合作用，最終發(fā)現(xiàn)0.1 mol/L EDTA作為絡(luò)合劑時喹諾酮類藥物的回收率最好。因此在提取過程中，選擇2%甲酸乙腈溶液和0.1 mol/L EDTA共同提取樣品。

2.5 樣品凈化

在本實驗中，選用PRIME-HLB固相萃取柱、安捷倫QuEChERS快速提取和QuEChERS EMR-Lipid快速提取對樣品進行凈化。結(jié)果表明PRIME-HLB固相萃取柱只對其中的一部分藥物有提取，其余藥物的提取率低，所以我們選擇了安捷倫QuEChERS快速提取進行樣品進化。雞蛋中的蛋白質(zhì)含量特別高，而脂質(zhì)干擾是測定食品或生物基質(zhì)中痕量殘留物面臨著重要難題，不僅導(dǎo)致分析物靈敏度下降，還會導(dǎo)致 MS維護的需求增加從而縮短儀器和色譜柱壽命，所以去除脂質(zhì)在痕量檢測中尤為重要。我們比較了安捷倫傳統(tǒng) QuEChERS和增強型脂質(zhì)去除產(chǎn)品（QuEChERS EMR-Lipid）對樣品進行凈化處理的效果，發(fā)現(xiàn)QuEChERS EMR-Lipid對脂質(zhì)的去除率較好，而且分析物的回收率也較高。所以我們選擇 QuEChERS EMR-Lipid進行樣品凈化過程。

在使用 QuEChERS EMR-Lipid萃取管進行樣品凈化時，QuEChERS EMR-Lipid快速萃取提取管的活化效果直接影響了檢測結(jié)果的好壞。本實驗比較了純水、pH 2.4、0.1 mol/L乙酸銨、pH 2.4、0.1 mol/L EDTA、pH 4.0、0.1 mol/L EDTA、pH 7.0、0.1 mol/L EDTA活化提取管，但發(fā)現(xiàn)純水活化時，只有磺胺類藥物有回收；pH 4.0、0.1 mol/L EDTA活化時喹諾酮類藥物開始有回收，但較低；pH 7.0、0.1 mol/L EDTA活化時喹諾酮類藥物回收較好，但磺胺類藥物又沒有了回收；而pH 2.4、0.1 mol/L EDTA活化時，由于溶液太酸，EDTA有析出現(xiàn)象；而用pH 2.4、0.1 mol/L乙酸銨活化萃取管中，磺胺類藥物和喹諾酮類藥物均有回收，而且回收率較好，最終選擇pH 2.4、0.1 mol/L乙酸銨作為萃取管的活化液進行活化。

2.6 檢測方法的線性關(guān)系、檢測限（LOD）與定量限（LOQ）的確定

配制一系列標(biāo)準工作溶液，做基質(zhì)標(biāo)準曲線進行定量分析，其線性范圍(Linear ranges)和相關(guān)系數(shù)(Correlation coeficiants)見表1。按3倍信噪比計算定為檢測限（LOD），10倍信噪比定為定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

2.7 檢測方法回收率和精密度確定

準確稱取空白樣品，分別添加高、中、低三個濃度標(biāo)準溶液，每個添加濃度平行測定6次，按1.2所述方法進行處理分析，進行樣品分析。藥物的回收率較好，回收率范圍為50.09%～102.11%之間，精密度也較好，相對標(biāo)準偏差小于20%，方法滿足質(zhì)量控制要求[30]，結(jié)果見表3。

表2 目標(biāo)分析物的質(zhì)譜檢測參數(shù)、工作曲線線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Table 2 Tandem mass parameters, linear ranges, correlation coef fi cients, LOD and LOQ of target analyte drugs

表3 空白樣品中30種獸藥的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準偏差Table 3 Recovery and relative standard deviation for 30 antibiotics in eggs(%, n=6)

3 結(jié)論

食品中抗生素殘留檢測屬于較為復(fù)雜的痕量組分分析技術(shù)，最顯著的特點是需要嚴格的樣本前處理步驟，因為前處理的操作直接影響檢測結(jié)果的準確性和可靠性[31]，所以能集采樣、萃取、凈化、濃縮、預(yù)分離、進樣于一身的聯(lián)用和自動化分析等將是未來發(fā)展的趨勢。而本實驗中的檢測樣品禽蛋中的蛋白質(zhì)含量較高，在前處理過程中去除脂肪的步驟也非常關(guān)鍵，其脂肪去除的干凈程度直接影響了實驗的最終結(jié)果。但目前報道所用的多數(shù)方法通常都會在去除脂質(zhì)的損失一部分目標(biāo)物，從而使目標(biāo)物的回收率受到的影響。所以本實驗在樣品前處理過程中，采用了創(chuàng)新型安捷倫增強型脂質(zhì)去除產(chǎn)品（QuEChERS EMR-Lipid）萃取技術(shù)凈化樣品，此技術(shù)可針對任意樣品前處理產(chǎn)品實現(xiàn)最徹底的脂質(zhì)去除和分析物回收，不僅提高了方法的靈敏度，還提高了樣品的回收率和精密度。而且其操作步驟也比較簡單，樣品前處理時間也較短，不僅減少了操作過程中的各種誤差，而且其還大大節(jié)省了樣品前處理的時間，適用于大批量產(chǎn)品的快速檢測。本試驗利用高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測禽蛋中磺胺類藥物和喹諾酮類藥物的多殘留含量，不僅具有液相色譜對藥物的高效分離特點，也具有質(zhì)譜對分析物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的定性分析特性，同時達到了定性和定量的檢測目的，特別適用于獸藥痕量殘留的確證性分析檢測，而且在檢測結(jié)果上大大提高了方法的靈敏度和精確度，所得檢測限也比較低，磺胺類藥物 檢 測 限 為 0.0013～0.0166 μg/kg， 定 量 限0.0044～0.0552 μg/kg；喹諾酮類藥物檢測限為0.0018～0.0972 μg/kg，定量限 0.0060～0.3239 μg/kg，遠遠小于歐美國家和我國農(nóng)業(yè)部制定的最高殘留限量。與其他液質(zhì)聯(lián)用法相比，檢測限也有所降低，如王浩[25]等用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對牛奶中10種磺胺類藥物殘留，檢出限可達到0.5～1.0 μg/L；郭黎明[26]等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在正離子模式下通過多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式同時測定了雞肝臟組織中3種四環(huán)素類藥物、10種磺胺類藥物以及8種喹諾酮類藥物的殘留，該方法對測定的21種藥物的檢出限均為2 μg/kg，定量限均為5 μg/kg。張萍[11]等建立雞蛋粉中12種磺胺類藥物殘留量的測定方法，最小檢出限在0.002～0.045 μg/g。Schneiderd等使用LC/MC測定了牛和雞的肝組織中的 sAs，檢測限為 0.8～1.7 μg/kg。所以本文建立的QuEChERS EMR-Lipid結(jié)合LC-MS/MS檢測雞蛋中多種磺胺類藥物和喹諾酮類藥物殘留含量的檢測方法具有高靈敏度、高精密度、前處理操作簡便、快速省時等優(yōu)點，測定的30種獸藥殘留的含量結(jié)果均能滿足雞蛋中多種藥物殘留檢測的限量要求及相應(yīng)的檢測水平，并適用于市場禽蛋中多類獸藥的監(jiān)督抽查工作，在理論和生產(chǎn)實踐上都具有重要意義。