徐春卓，辛穎

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒內(nèi)分泌遺傳代謝科，沈陽 110004）

宮內(nèi)發(fā)育遲緩 （intrauterine growth retardation，IUGR） 一般是指出生時的體質(zhì)量 （birth weight，BW）低于同胎齡、同性別平均體質(zhì)量的第10百分位數(shù)或2個標(biāo)準(zhǔn)差新生兒［1］。IUGR是圍產(chǎn)期致死率的主要原因之一，約占死亡率的5%～10%［2］。胰島結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生、發(fā)育、增殖、成熟以及胰島素合成與分泌中任何程序出現(xiàn)錯誤，都可能使血糖升高并可導(dǎo)致糖尿病發(fā)生風(fēng)險增加［3-5］。妊娠期是胰腺發(fā)育的關(guān)鍵時期，胰腺良好發(fā)育是實(shí)現(xiàn)其功能作用的基石，因此胰腺發(fā)育期是探討糖尿病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵時期。

在胰腺發(fā)育過程中，內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生于Ngn3標(biāo)記的胰腺祖細(xì)胞［6］。Ngn3 屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋bHLH （basic helix-loop-helix） 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，研究［7］認(rèn)為Ngn3是內(nèi)分泌祖細(xì)胞標(biāo)記物，對于內(nèi)分泌細(xì)胞的命運(yùn)具有決定作用。研究［8］發(fā)現(xiàn)Ngn3在內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生、再生、重編程方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Ngn3突變小鼠內(nèi)分泌缺失，4種胰島細(xì)胞和內(nèi)分泌前體細(xì)胞在各個階段都出現(xiàn)缺失，小鼠在圍生期死于糖尿?。?］。由此可見，Ngn3正常表達(dá)對于維持內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要。本研究采用全孕期低蛋白飼料喂養(yǎng)的營養(yǎng)不良法建立IUGR大鼠模型，檢測IUGR組大鼠Ngn3蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證IUGR對內(nèi)分泌祖細(xì)胞發(fā)育的影響，從胰腺發(fā)育的角度探討糖尿病發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

選取體質(zhì)量230～280 g、健康雌性、處女Wistar大鼠 （長生公司） ，由實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級別適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，雌雄 （4∶1） 大鼠合籠，確認(rèn)已受孕的大鼠 （共36只） 根據(jù)喂養(yǎng)飼料 （北京華阜康公司） 不同隨機(jī)分成2組：全孕期低蛋白飲食組 （18只） ，標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食組 （18只） 。標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食組蛋白含量為22%，其子鼠為CON組；低蛋白飲食組給予8%蛋白，其子鼠為IUGR組。隨機(jī)選取孕第15.5天 （E15.5） 、第18.5天（E18.5） 、新生第1天 （P1） 低蛋白飲食組和標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食組大鼠，剖宮產(chǎn)或自然娩出胎鼠或新生鼠，記錄IUGR組體質(zhì)量低于CON組體質(zhì)量2個標(biāo)準(zhǔn)差的胎鼠或新生鼠，確定為E15.5、E18.5、P1 IUGR子鼠造模成功。

1.2 標(biāo)本采集及處理

E15.5、E18.5時的胎鼠由孕鼠采用異氟烷麻醉，剖宮產(chǎn)取出；新生鼠自然分娩所得。稱重，符合IUGR標(biāo)準(zhǔn)的在解剖顯微鏡下迅速分離胰腺組織；將分離胰腺置于4%多聚甲醛中48 h，以備石蠟包埋使用。

1.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

石蠟包埋胰腺組織，將蠟塊切成3.5 μm切片，每組每只大鼠胰腺標(biāo)本取2張胰腺石蠟切片，HE染色，采用Eclipse 80i圖像分析系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，每張切片隨機(jī)選取1～2個高倍視野，觀察胰腺腺泡、導(dǎo)管及胰島發(fā)育情況。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

脫蠟水化，檸檬酸鹽微波7 min煮沸修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS水洗后用山羊血清封閉，一抗Ngn3 （1∶30，英國Abcam公司） 4℃冰箱孵育12h后室溫復(fù)溫，二抗37 ℃孵育，辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素37 ℃孵育，DAB顯色，蘇木素染核，脫水，透明，封固。鏡下觀察細(xì)胞，出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IUGR組和CON組胎鼠與新生鼠體質(zhì)量比較

采用全孕期低蛋白飲食方法制造IUGR大鼠動物模型。結(jié)果顯示，IUGR組體質(zhì)量均明顯低于CON組 （均P ＜ 0.05） ，E15.5、E18.5、P1 IUGR子鼠造模成功。見表1。

2.2 胎鼠和新生鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)觀察

表1 IUGR 組和CON組胎鼠及新生大鼠體質(zhì)量比較 （g）Tab.1 Comparison of body weights between embryonic and newborn rats in the IUGR and CON groups （g）

結(jié)果顯示，CON組E15.5時，胰腺腺泡、導(dǎo)管結(jié)構(gòu)已出現(xiàn)，腺泡、導(dǎo)管數(shù)量較多、體積稍大，排列密集；E18.5時，胎鼠β細(xì)胞開始聚集，胰島結(jié)構(gòu)初步形成；P1時可見胰腺內(nèi)外分泌部的典型結(jié)構(gòu)已形成，胰島數(shù)量較多，面積較大，胰島結(jié)構(gòu)飽滿、清晰。IUGR組與CON組比較，E15.5時腺泡導(dǎo)管結(jié)構(gòu)體積小、數(shù)量少，排列較松散，E18.5時組織彌散，P1時則胰島數(shù)量及面積減少，分布相對不規(guī)則、散亂。見圖1。

圖1 CON組和IUGR組不同發(fā)育階段胰腺光鏡檢測結(jié)果 HE染色Fig.1 Light microscope observations of pancreatic tissues in control and IUGR rats HE

2.3 胎鼠和新生鼠發(fā)育各時期胰腺組織中Ngn3蛋白表達(dá)位置

通過免疫組織化學(xué)染色方法觀察2組Ngn3蛋白在E15.5、E18.5、P1時分布情況，結(jié)果顯示，E15.5時胰腺組織中Ngn3主要表達(dá)在胰腺導(dǎo)管、內(nèi)分泌細(xì)胞和腺泡；E18.5時Ngn3主要表達(dá)在胰腺導(dǎo)管、初步形成的小胰島，少量表達(dá)腺泡中；P1時Ngn3表達(dá)在胰腺的胰島中，少量表達(dá)在導(dǎo)管、腺泡中。CON組Ngn3蛋白陽性反應(yīng)部位的平均密度值隨著發(fā)育逐漸下降，對照組Ngn3蛋白陽性反應(yīng)部位的平均密度值與E15.5、E18.5比較P1時下降明顯 （P ＜ 0.01） 。IUGR組E15.5、 E18.5時低于CON組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P ＜ 0.05） ；P1時 Ngn3蛋白陽性反應(yīng)部位的平均密度值低于CON組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＞0.05） ，見圖2、表2。

3 討論

胎兒期與新生兒各器官發(fā)育、增殖、功能完善過程受營養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，營養(yǎng)物質(zhì)的數(shù)量和 （或） 質(zhì)量是保證正常發(fā)育的基礎(chǔ)。妊娠期是各器官發(fā)育的關(guān)鍵時期，此時營養(yǎng)不良將造成器官形成、發(fā)育及功能成熟的程序化錯誤。本研究通過采用全孕期低蛋白飼料喂養(yǎng)的營養(yǎng)不良法，發(fā)現(xiàn)E15.5、E18.5及新生仔鼠體質(zhì)量明顯減低，表明IUGR模型建立成功。研究［10］表明妊娠中晚期不利營養(yǎng)環(huán)境會導(dǎo)致胰島內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)發(fā)生永久性改變。結(jié)果顯示，HE染色方法發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段胰腺各細(xì)胞成分形態(tài)上逐漸成熟，與CON組比較，IUGR組胚胎期胰腺組織更加彌散，新生期胰島數(shù)量及面積減少，分布相對不規(guī)則、散亂，說明IUGR可使發(fā)育期胰腺結(jié)構(gòu)改變。

RUKSTALIS等［11］認(rèn)為Ngn3是胰腺胰島分化和再生的主要調(diào)節(jié)器。在胚胎胰腺發(fā)育過程中，Ngn3對于內(nèi)分泌的形成是必不可少的，近來KRENTZ等［12］發(fā)現(xiàn)Ngn3被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶磷酸化后降解，而G1期延長可使磷酸化水平下降，趨使內(nèi)分泌分化，由此可見細(xì)胞周期延長可使Ngn3降解減少，反之表達(dá)量相對升高，對于誘導(dǎo)內(nèi)分泌分化是至關(guān)重要的。AZZARELLI 等［13］發(fā)現(xiàn)在發(fā)育過程中Ngn3多位點(diǎn)磷酸化可調(diào)節(jié)胰腺內(nèi)分泌分化，同時在病理情況下維持成熟胰島β細(xì)胞功能。本研究發(fā)現(xiàn)Ngn3蛋白在胰腺發(fā)育的二次分化時表達(dá)高，此后隨著胎齡增長表達(dá)量逐漸降低，與以往結(jié)果一致，體現(xiàn)其在胚胎胰腺發(fā)育期的重要作用，這一現(xiàn)象可能與泛素化、類泛素化及蛋白酶體降解有關(guān)，也可能與Ngn3細(xì)胞增殖能力逐漸下降有關(guān)［14］。CARPINO等［15］研究表明胚胎胰腺導(dǎo)管中Ngn3 （+） 細(xì)胞可以被認(rèn)為是內(nèi)分泌祖細(xì)胞，具有促進(jìn)胰島素分泌的作用。本實(shí)驗(yàn)通過組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)在胚胎期Ngn3主要表達(dá)在胰腺的導(dǎo)管中，說明胚胎期位于胰腺導(dǎo)管中的Ngn3細(xì)胞具有分化為內(nèi)分泌細(xì)胞的潛能。

表2 2組Ngn3陽性反應(yīng)部位平均密度值比較Tab.2 Comparison of Ngn3 mean density between two groups

圖2 胚胎期和新生兒期IUGR組及CON組大鼠胰腺中Ngn3蛋白分布Fig.2 Immunohistochemical localization of Ngn3 in control and IUGR rats at different developmental stages

研究［16-17］發(fā)現(xiàn)Ngn3對于內(nèi)分泌分化不是必需的，但是其合適劑量對于保證內(nèi)分泌命運(yùn)卻是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)檢測了IUGR組E15.5、E18.5及新生期Ngn3蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量明顯下降，且與CON組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明IUGR嚴(yán)重影響Ngn3蛋白的表達(dá)量，導(dǎo)致內(nèi)分泌祖細(xì)胞減少，胰腺內(nèi)分泌發(fā)育異常。

綜上所述，孕期全程低蛋白飲食的營養(yǎng)不良可致大鼠發(fā)生IUGR，并影響胰腺中Ngn3的表達(dá)，Ngn3表達(dá)下降可能導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞分化及功能成熟障礙，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺發(fā)育不良，胰島數(shù)量及面積相應(yīng)減少。然而胰腺發(fā)育的過程極其復(fù)雜，并非單個基因的作用，是受多個基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同作用的結(jié)果，因此IUGR如何對胰島β細(xì)胞發(fā)育及功能造成影響還有待進(jìn)一步探索。