吳亞鋒，陳靜，倪金娣，劉迅猛，袁銳，王晶晶，方蘋

（江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210036）

異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）以其生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)在江蘇地區(qū)大量養(yǎng)殖，2017年江蘇年產(chǎn)量約60萬(wàn)t，占全國(guó)總產(chǎn)量近25%。隨著漁業(yè)養(yǎng)殖的規(guī)模化和集約化發(fā)展，各種魚病的暴發(fā)成了影響漁業(yè)養(yǎng)殖的重要制約因素。大量使用的抗生素和化學(xué)藥品不僅在水產(chǎn)品中殘留，危害人類健康，也污染水環(huán)境[1-2]。因此，研制飼料免疫增強(qiáng)劑，促進(jìn)魚體的疾病抵抗能力，對(duì)人工養(yǎng)殖異育銀鯽技術(shù)的發(fā)展具有極其重要的意義。

魚類免疫增強(qiáng)劑主要通過(guò)增強(qiáng)非特異性免疫應(yīng)答而發(fā)揮作用，如促進(jìn)補(bǔ)體、溶菌酶、蛋白酶抑制劑、反應(yīng)蛋白、天然溶血素、凝聚素、巨球蛋白、巨噬細(xì)胞活化因子和干擾素等的合成，活化巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞的吞噬殺菌功能[3]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種天然和人工合成的物質(zhì)可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物非特異性免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)其抗病力。Cárdenas等[4]研究認(rèn)為葡聚糖能夠刺激太平洋紅鯛魚頭腎白細(xì)胞的免疫機(jī)制，激活具有免疫的特性細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)嗜水氣單胞菌的抗侵襲能力。李超等[5]將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍(lán)根五味中草藥按等比的水提取物制成中草藥免疫增強(qiáng)劑，投喂后能顯著增強(qiáng)草魚生長(zhǎng)性能和免疫功能。沈錦玉等[6]指出殼聚糖能提高中華絨螯蟹非特異性免疫功能，對(duì)嗜水氣單胞菌免疫保護(hù)率高達(dá)75%，較好地預(yù)防病害的發(fā)生。

為進(jìn)一步了解不同免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治上的應(yīng)用前景，該試驗(yàn)在異育銀鯽的飼料中添加3種免疫增強(qiáng)劑，分析異育銀鯽血清中的兩種非特異性免疫指標(biāo)，研究添加劑能否增強(qiáng)鯽魚的免疫功能，從而增強(qiáng)抵抗疾病的能力，為安全有效預(yù)防病害提供科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)防病綠色飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用異育銀鯽，購(gòu)于江蘇鹽城市大豐區(qū)林松養(yǎng)殖場(chǎng)，80日齡左右，體長(zhǎng)5～6 cm，平均體質(zhì)量（23.94±0.84）g。試驗(yàn)開始前用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)14 d，以適應(yīng)環(huán)境和試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)開始后，每日于8：00、17：00投喂2次，投飼量為魚體質(zhì)量的3%，并根據(jù)生長(zhǎng)、攝食情況作調(diào)整。每天于18：00換水1次，每次換水三分之一。水族缸規(guī)格為：80 cm×60 cm×120 cm，24 h不間斷充氣。靜水養(yǎng)殖期間，水溫為25℃左右，pH值為7.1左右，溶解氧約為7.3 mg/L，養(yǎng)殖時(shí)間為30 d。

1.2 試驗(yàn)藥餌飼料制備

基礎(chǔ)飼料是“通威191高蛋白鯽魚育成配合型飼料”，粒徑為1.5 mm，配方表見表1。在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同比例的酵母多糖、殼聚糖和維生素K，共6個(gè)試驗(yàn)組，一個(gè)對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，各組功能飼料的成分組成見表2。

表1 基礎(chǔ)飼料的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)

表2 各組功能飼料的成分組成

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將1 050尾暫養(yǎng)規(guī)格相同的健康異育銀鯽隨機(jī)分成7組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50尾。先用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)，再用試驗(yàn)功能飼料投喂。每個(gè)重復(fù)分別在用功能飼料投喂的第 0、4、7、10、15、20、30 天隨機(jī)取3尾供試魚，測(cè)定非特異性免疫指標(biāo)，測(cè)完免疫指標(biāo)后的魚不再用于該試驗(yàn)。

1.4 樣品的采集與測(cè)定

從尾靜脈無(wú)菌采血1 mL，不加抗凝劑，在37℃靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min取上層血清，在超低溫冰箱（-80℃）中保存?zhèn)溆?。使用南京建成生物工程研究所的試劑盒和酶?biāo)儀測(cè)定各樣品中溶菌酶（LSZ）和超氧化物歧化酶（SOD）的活力。血清中SOD酶活性單位定義為每毫升血清中SOD抑制率達(dá)到50%所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)酶活性單位。

1.5 免疫保護(hù)率

從每個(gè)重復(fù)剩下的魚中隨機(jī)取10尾魚測(cè)定免疫保護(hù)率。攻毒菌株為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）JYZ170428GSU3，在預(yù)試驗(yàn)中根據(jù)Bliss法計(jì)算對(duì)異育銀鯽半數(shù)致死量為1.37×106cfu/mL。每尾試驗(yàn)魚腹腔注射0.2 mL，6.85×106cfu/mL嗜水氣單胞菌新鮮菌液，對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，統(tǒng)計(jì)病死率，按照以下公式計(jì)算免疫保護(hù)率：免疫保護(hù)率（%）=［1-（受免魚死亡尾數(shù)/對(duì)照魚死亡尾數(shù)）］×100。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽血清溶菌酶（LSZ）活性的影響

由表3可知，維生素K試驗(yàn)組對(duì)異育銀鯽血清溶菌酶活性影響最大，第4天就顯著提高（P＜0.05），低劑量和高劑量組LSZ活性峰值分別為34.52、35.05 U/mL，為各試驗(yàn)組最高；殼聚糖組和合酵母多糖組效果略差，與對(duì)照組相比，到第7天LSZ活性才有顯著性差異（P＜0.05），且峰值略低。

從時(shí)間進(jìn)展來(lái)看，各試驗(yàn)組LSZ活性在第0天時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在第7天時(shí)各試驗(yàn)組LSZ活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），在第10天，酵母多糖高劑量組和維生素K高劑量組達(dá)到峰值，隨后下降；在第20天，免疫增強(qiáng)劑刺激效應(yīng)減弱，除酵母多糖高劑量組外，其余試驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽血清超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響

由表4可知，酵母多糖和殼聚糖對(duì)異育銀鯽血清超氧化物歧化酶（SOD）活力影響較大，從第4天至第30天，與對(duì)照組相比均差異顯著（P＜0.05）。維生素K對(duì)SOD活力影響較小，與對(duì)照組相比，到第7天才有顯著性差異（P＜0.05），且峰值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于多糖組。

表3 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽血清溶菌酶含量的影響U/mL

從時(shí)間進(jìn)展分析，各個(gè)試驗(yàn)組總體先上升再下降的趨勢(shì)，但在第30天依然差異顯著。各試驗(yàn)組SOD活性在第0天時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在第4天，酵母多糖和殼聚糖組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；第7天至第30天，各試驗(yàn)組SOD活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；殼聚糖組在第10天SOD活力達(dá)到峰值，而酵母多糖組、維生素K組在第15天SOD活力達(dá)到峰值。3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)血清SOD活力影響較大，低劑量組也能很好的免疫效果，除酵母多糖組的第10、15天，以及殼聚糖組的第4、7天外，其余時(shí)間點(diǎn)，各增強(qiáng)劑低劑量和高劑量組差異不顯著（P＞0.05）。

表4 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽超氧化物歧化酶含量的影響 U/mL

2.3 三種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽免疫保護(hù)率

由表5可知，3種免疫增強(qiáng)劑中，對(duì)異育銀鯽免疫保護(hù)率最高的是高劑量殼聚糖組，為67.5%，最低的是高劑量維生素K組，為12.5%。從總體效果來(lái)講，相同劑量下免疫保護(hù)率的順序?yàn)椋簹ぞ厶牵窘湍付嗵牵揪S生素K。

表5 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽的免疫保護(hù)率

3 討論

3.1 3種免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽非特異性免疫功能的影響

該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼料中不同添加量的免疫增強(qiáng)劑均能提高異育銀鯽的非特異性免疫能力，表現(xiàn)為血清溶菌酶（LSZ）活力和血清超氧化物岐化酶（SOD）活力均顯著高于對(duì)照組。

酵母細(xì)胞壁多糖是從酵母細(xì)胞壁中分離出來(lái)的一些大分子多糖物質(zhì)，存在特殊的鍵結(jié)方式和分子氫鍵的，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力[7]。該研究中，酵母多糖對(duì)異育銀鯽血清中SOD活力影響較大而對(duì)LSZ活力影響較小，這可能與添加量有關(guān)。姚嘉赟等[8]研究酵母多糖、黃芪和參芪3種不同免疫增強(qiáng)對(duì)黃顙魚免疫功能的影響，也發(fā)現(xiàn)類似的問(wèn)題，與酵母多糖低劑量組相比，酵母多糖高劑量組對(duì)LSZ活性差異極顯著（P＜0.01），而對(duì)SOD的活力，二者差異并不顯著。但與對(duì)照組相比，酵母多糖組對(duì)增強(qiáng)魚類的非特異性免疫依然具有較好的作用，而且酵母多糖的效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于黃芪和參芪。劉洪梅等[9]研究表明基礎(chǔ)飼料中添加酵母多糖后，鯉魚的生長(zhǎng)性能和免疫功能等相關(guān)指標(biāo)都較對(duì)照組顯著提高。

殼聚糖可以活化巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞來(lái)表達(dá)一些引起發(fā)炎反應(yīng)的細(xì)胞因子，如白介素-1、集落刺激因子和γ干擾素等。Rusell等[10]研究虹鱒甲殼素結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)，甲殼素結(jié)合蛋白存在于虹鱒的鰓、脾臟、肝竇、腎間質(zhì)腸、皮膚、魚鰾以及白細(xì)胞內(nèi)部。這種蛋白質(zhì)與人和嚙齒類的一種血漿凝集素屬于同源蛋白，上面還有多種受體，通過(guò)一種與乙?；募讱に鼗蚣讱に仄胃哂H和性的鈣依賴性途徑參與到細(xì)胞內(nèi)吞作用中。陳勇等[11]研究認(rèn)為殼聚糖通過(guò)提高血清T3水平、降低血清皮質(zhì)醇水平增強(qiáng)異育銀鯽的非特異免疫功能。該研究中，殼聚糖能顯著提高LSZ和SOD的活力，異育銀鯽非特異性免疫能力顯著提高。這與張濤[12]在飼料中添加了0.22%、0.44%、0.66%的酵母多糖后，草魚血清溶菌酶（LSZ）活性均顯著提高（P＜0.05）相近。華雪銘等[13]也認(rèn)為殼聚糖、益生菌、益生菌與殼聚糖混合物或甘露聚糖與益生菌混合物作為飼料添加劑具有調(diào)節(jié)魚類免疫功能和免疫重建的作用。

在水產(chǎn)動(dòng)物中，維生素K的研究主要集中在體內(nèi)發(fā)揮的生理功能和對(duì)它的需求上[14]，對(duì)于維生素K對(duì)水生動(dòng)物非特異性免疫功能影響的研究報(bào)道比不多見。該研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加一定劑量的維生素K，也能顯著提高異育銀鯽非特異性免疫能力。這與王洋等[15]認(rèn)為適當(dāng)濃度維生素K對(duì)SOD活性有激活效應(yīng)相符合。但相同劑量下維生素K提高LSZ的能力顯著高于多糖組，維生素K影響調(diào)控LSZ的機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

3.2 不同添加量免疫增強(qiáng)劑對(duì)異育銀鯽非特異性免疫功能的影響

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，同種免疫增強(qiáng)劑添加劑量不同，其使用效果也存在一定的差異。該研究中，在第10天至第30天，酵母多糖低劑量組SOD活力的增長(zhǎng)反而顯著高于酵母多糖高劑量組；維生素K對(duì)血清中LSZ活力的影響也存在同樣的現(xiàn)象。劉愛君等[16]用奧尼羅非魚做試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)飼料中添加0.50%～0.75%甘露聚糖，均可提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率和機(jī)體免疫力，但添加劑量為0.50%時(shí)最佳。Siwicki等[17]研究了口服不同劑量的左旋咪唑?qū)琪V抗出血病的作用，結(jié)果顯示添加量10～20 mg/Kg，有良好的免疫保護(hù)力；當(dāng)劑量上升到50 mg/Kg時(shí)，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。這可能是因?yàn)闄C(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)免疫增強(qiáng)劑刺激的代償性反應(yīng)。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的日益重視，免疫增強(qiáng)劑以毒副作用小，易分解，在環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)無(wú)殘留，既能提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，又能提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病力的優(yōu)點(diǎn)，可以作為預(yù)防水產(chǎn)疾病暴發(fā)的好產(chǎn)品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中將越來(lái)越受歡迎。目前，多種復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)和趨勢(shì)[18-20]。該研究證實(shí)了酵母多糖和殼聚糖對(duì)異育銀鯽非特異性免疫的增強(qiáng)作用，探究了維生素K與魚類免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系，為進(jìn)一步研發(fā)新型復(fù)合型免疫增強(qiáng)劑提供科學(xué)依據(jù)。這3種免疫增強(qiáng)劑具有廉價(jià)易得，且性質(zhì)穩(wěn)定易儲(chǔ)存，值得在今后養(yǎng)殖生產(chǎn)中加以大力推廣。