趙素芬 ，周多妍 ，黃素堅 ，胡霖輝 ，孫會強

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，熱帶海產(chǎn)經(jīng)濟無脊椎動物健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東省南海經(jīng)濟無脊椎動物健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，廣東省藻類養(yǎng)殖與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)數(shù)學(xué)與計算機學(xué)院，廣東 湛江 524088）

雷州馬尾藻（Sargassum leizhouense）是我國的特有種[1-2]。藻體中含有豐富的營養(yǎng)成分，可用于制作保健食品和藥物。并且作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中的初級生產(chǎn)力，在改善海洋環(huán)境、凈化水產(chǎn)動物養(yǎng)殖水體、為海洋動物提供棲息地和繁育場所等方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。近幾年，開展馬尾藻的人工繁育和養(yǎng)殖已十分必要[5]。人工繁育中篩選采苗用的附著基是苗種培育過程中的一個重要環(huán)節(jié)，選擇適宜的附著基及采苗時機是育苗成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。羊棲菜和鼠尾藻等人工育苗的附著基篩選已有研究[6-7]。而有關(guān)附著基對雷州馬尾藻采苗效果的影響未見報道。該文用幾種不同附著基采集雷州馬尾藻的受精卵，并研究其受精卵脫落后的附著能力隨時間的強弱變化，旨在了解雷州馬尾藻采苗的適宜附著基種類，并確定最佳的采苗時間，以期為后續(xù)的馬尾藻人工繁育和栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雷州馬尾藻種藻采集于湛江市徐聞海域，采集當天用濕運法運輸至廣東海洋大學(xué)實驗室，海水用前經(jīng)網(wǎng)孔為50 μm的篩絹網(wǎng)過濾。藻體經(jīng)過清洗，去除其表面的雜藻及其他附著物后暫養(yǎng)保存。暫養(yǎng)條件：室溫15～21℃，水體鹽度24～32，自然光照，光照強度介于0～150 μmol/（m2·s）之間，充氣培養(yǎng)。暫養(yǎng)期間每2 d更換1次海水。

選取竹片、棕繩、貝殼（文蛤殼）、尼龍繩、布簾、石子作為附著基，用前清洗并在淡水中浸泡一周（竹片和尼龍繩煮沸后浸泡），每天定時換水，用前在消毒（立式壓力蒸汽滅菌器BXM-30R，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）的海水中浸泡1 d。

1.2 方法

1.2.1 種藻促熟 選取生殖托顏色深褐、較成熟、完整無損傷、大小均勻的雌雄藻體，用消毒刀片分離側(cè)枝，然后在海水中反復(fù)洗刷，以清除其表面的雜藻及其他附著雜物，再用消毒刀片將大小一致的生殖托切下，以雌雄3：1的比例將生殖托放置于2 L燒杯中，加入經(jīng)煮沸消毒后冷卻的海水，置于光照培養(yǎng)箱（PGX-280A-12H，寧波萊福科技有限公司）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度23℃，光照強度80 μmol/（m2·S），光周期 12D：12L，海水鹽度 29～30，每天定時搖動3次，定時換水，密切觀察（顯微鏡OLYMPUS BX51）待其排卵受精。

1.2.2 不同附著基的附著效果 將150 mL燒杯和培養(yǎng)皿清洗、消毒、冷卻后備用。放入處理過的竹片、棕繩、貝殼、尼龍繩、布簾、石子附著基，每種設(shè)6個平行，每個燒杯中加入過濾消毒海水40 mL，20個剛脫落的受精卵，密封，靜置于自然條件下培養(yǎng)（溫度 19.5～22.0 ℃，濕度 78%～92%，光照 0～5.1 μmol/（m2·S），48 h和72 h后每種附著基各取3個平行樣本分別用消毒海水沖刷，壓強為0.6 kg/cm2，計數(shù)沖刷掉落的受精卵或苗體數(shù)量。

1.2.3 受精卵的附著能力 在150 mL燒杯中放入貝殼附著基，并加入消毒海水40 mL。分別采集脫落前、剛脫落、脫落后 6、12、18、24、36、48 h 的受精卵，置于燒杯中貝殼上，每組3個平行。用保鮮膜密封，靜置于自然條件下培養(yǎng)（同上）。24 h和36 h后用消毒海水沖刷，計數(shù)沖刷數(shù)量，觀測受精卵的附著能力。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用Excel 2003、統(tǒng)計軟件 SPSS 19.0處理，結(jié)果用平均值±標準誤表示,并進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷州馬尾藻受精卵在不同附著基上的附著效果

圖1 雷州馬尾藻受精卵在不同附著基上的附著效果

2.1.1 受精卵在不同附著基上的附著率 雷州馬尾藻受精卵在竹片、棕繩、貝殼、尼龍繩、布簾、石子6種附著基上的附著效果差異具統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。雷州馬尾藻受精卵附著48 h后，附著率均高于（72.2±2.6）%，其中貝殼上附著率最高，達到（96.7±3.3）%，其次是棕繩、布簾和尼龍繩，在竹片與石子上的附著率最低。72 h后，附著率均高于（76.7±6.7）%，最高為貝殼，附著率100%，棕繩和布簾較為接近，分別為（90.0±5.8）%、（89.7±5.8）%，附著率最低為竹片和石子?？傊?，雷州馬尾藻受精卵在貝殼上的附著效果最好，其次是棕繩和布簾，尼龍繩、竹片和石子較差。

2.1.2 不同附著基上幼苗的生長情況 雷州馬尾藻受精卵在不同附著基上培養(yǎng)48 h后，鏡檢觀察幼孢子體的生長情況（見圖2）。由圖2可見，各種附著基上的幼孢子體均長出細長假根，假根數(shù)量在3～6根不等，除了在竹片上的假根較少而短外，其他附著基上的假根長度等于或超過幼孢子體的長徑。培養(yǎng)72 h后，除假根數(shù)量與長度稍有增長外，其他無明顯變化。在整個實驗過程中，除竹片附著基上有1個受精卵出現(xiàn)發(fā)黑死亡外，其余的雷州馬尾藻幼孢子體均呈現(xiàn)較健康透亮的黃褐色。

圖2 受精卵在不同附著基上培養(yǎng)48 h后的生長情況

2.2 受精卵在自然脫落前后不同時間轉(zhuǎn)移至貝殼上的附著效果

2.2.1 受精卵的附著率 用貝殼作附著基，于自然脫落前后不同時間采集雷州馬尾藻的受精卵進行附著培養(yǎng)，其附著效果具有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異（P＜0.05），見圖3。脫落后24 h之內(nèi)或 24 h以上至48 h，受精卵轉(zhuǎn)移后的附著率隨脫落時間的延長而逐步下降，脫落24 h時轉(zhuǎn)移的受精卵具有最強的附著能力，附著率達到100%。脫落前或剛脫落時比脫落后超過24 h轉(zhuǎn)移的受精卵具有更高的附著率。

圖3 雷州馬尾藻受精卵脫落前后不同時間在貝殼上的附著效果

2.2.2 受精卵脫落前后不同時間在貝殼上的生長情況 采集自然脫落前后不同時間的受精卵，經(jīng)靜置密封培養(yǎng)24 h后，鏡檢觀察苗的生長情況（見圖4）。采集脫落前及剛脫落的受精卵培養(yǎng)，均未長出假根，而脫落6 h至48 h的受精卵均長出假根，數(shù)量4根以上不等，假根長度大多未超過幼孢子體長徑。幼孢子體呈現(xiàn)較健康透亮的黃褐色，生長正常。

圖4 受精卵脫落前后不同時間轉(zhuǎn)移至貝殼上培養(yǎng)24 h后的生長情況

3 討論

附著基的種類及其表面粗糙程度是影響海藻生殖細胞附著的重要因素[2,6-7]。該研究中，幾種附著基上雷州馬尾藻受精卵的附著率有明顯差異，貝殼是最佳附著基質(zhì)，但對鼠尾藻而言，同樣在靜水中采苗48 h，其受精卵在貝殼與其他附著基上附著效率受附著基材質(zhì)影響不顯著，并且附著率僅60.3%～73.6%[8]，低于該研究結(jié)果，可見不同種馬尾藻的受精卵在同一基質(zhì)表面的附著能力有差異。施超等[9]研究認為附著基的粗糙度對無鞭毛的繁殖細胞萌發(fā)的影響顯著，并且二者在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，而該文雷州馬尾藻受精卵無鞭毛，貝殼表面比其他附著基光滑，附著率卻最高，因此海藻孢子的附著密度與附著基表面的粗糙程度的相關(guān)性有待進一步研究。駱其君[10]研究了羊棲菜在5種材料的附著基上附著、生長情況，發(fā)現(xiàn)竹簾效果較好，而維尼綸繩、布料和礁石效果較差，該研究中竹片效果不及貝殼，可能與培養(yǎng)時間有關(guān)，該文僅研究雷州馬尾藻受精卵脫落3 d的情況，即幼孢子體發(fā)育早期的情況，而前者研究了20～120 d的幼孢子體附著、生長情況，表明隨著幼孢子體的發(fā)育，其在不同附著基上的附著、生長情況會發(fā)生變化，需要根據(jù)培養(yǎng)的目的選擇合適的附著基。

馬尾藻排出后的卵有較強黏性，通常從窩孔排出后黏在生殖托上，在母體上進行早期的細胞分裂，受精卵發(fā)育到一定程度后長出假根[9]，因此馬尾藻受精卵在假根出現(xiàn)前后分別依靠自身的黏性和假根固著在基質(zhì)上。研究發(fā)現(xiàn)采集沒脫落或剛自然脫落的受精卵，置于貝殼上培養(yǎng)24 h，受精卵未長出假根，均依靠膠質(zhì)黏附于貝殼上發(fā)育。而受精卵在脫離母體30 h后便可依靠長出的假根固著生長，但從轉(zhuǎn)移受精卵使其附著的實驗結(jié)果看出，受精卵長出假根后即接觸適宜的附著基有利于其生長，否則受精卵脫落超過60 h再附著，附著率顯著降低，因此在雷州馬尾藻幼苗培育中，可選擇貝殼附著基采苗，投放附著基的時間宜早于受精卵脫落60 h之前。