王 軍，宋予震，皇甫和平，石冬梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學院，河南鄭州450046)

近幾年，隨著我國貯運加工技術(shù)的提高和市場經(jīng)濟的帶動，乳業(yè)的發(fā)展越來越快，繼而奶牛養(yǎng)殖業(yè)也加快了發(fā)展的步伐，奶牛養(yǎng)殖數(shù)量與日俱增，養(yǎng)殖場的規(guī)模逐漸增大，隨之而來出現(xiàn)了不同規(guī)模的養(yǎng)殖場，但是，隨著養(yǎng)殖數(shù)量和養(yǎng)殖場規(guī)模的改變，奶牛疾病也越來越趨于復(fù)雜化，繁殖障礙性疾病也越來越多，奶牛子宮內(nèi)膜炎就是其中之一。奶牛子宮內(nèi)膜炎是主要的產(chǎn)科疾病，大多數(shù)是由于圍產(chǎn)期奶牛病原微生物感染所引起的一種繁殖障礙性疾病，主要導(dǎo)致產(chǎn)犢間期延長、產(chǎn)奶量降低、牛奶質(zhì)量降低，進而影響奶牛的繁殖性能，也是奶牛不孕不育的主要原因之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的后果，經(jīng)濟損失嚴重。由于子宮內(nèi)膜炎不出現(xiàn)全身性的發(fā)熱、炎癥、采食量下降和疼痛等臨床癥狀，特別是隱性子宮內(nèi)膜炎，易被飼養(yǎng)者忽視，造成奶牛產(chǎn)奶量降低，淘汰率升高的主要原因[1]。為了解和掌握該病的發(fā)生、流行現(xiàn)狀和致病因素，有效的防治子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生和保障乳業(yè)的健康發(fā)展[2]。因此，本課題組于2016年5月至2017年4月期間，抽取鄭州市區(qū)不同養(yǎng)殖場圍產(chǎn)期陽性奶牛奶樣88份進行了細菌學分析，以期望為奶牛子宮內(nèi)膜炎病的防控提供理論依據(jù)，引導(dǎo)人們科學健康地養(yǎng)殖奶牛。

1 材料與方法

1.1 試驗被檢牛 2016年5月至2017年4月期間，對鄭州市8個奶牛場確診患有子宮內(nèi)膜炎的奶牛共88頭子宮內(nèi)容物進行了取樣，用于奶牛子宮內(nèi)膜炎細菌分離和鑒定，同時隨機抽取圍產(chǎn)期奶牛進行流行病學調(diào)查。

1.2 試驗器材 德國Eppendorf移液器系列，海爾超低溫冰箱，上海精宏全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZP-250)，上海精宏電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9140A)，無菌操作臺一架，奧林巴斯CKX41-A32RC型顯微鏡，載玻片，蓋玻片，血瓊脂培養(yǎng)基，改良沙氏瓊脂培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，普通肉湯培養(yǎng)基，雙抗巧克力瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基等，培養(yǎng)皿，無菌試管若干，酒精燈，接種環(huán)，壓力鍋，恒溫培養(yǎng)箱，電冰箱和染色液等。

1.3 統(tǒng)計學方法 資料輸入計算機，經(jīng)核對后用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗，以P<0.05時差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 方法

2.1 病原菌分離方法

2.1.1 樣品的采集 將確診子宮內(nèi)膜炎的患牛進行保定，消毒液清洗外陰部，然后采集子宮內(nèi)容物。抽取的內(nèi)容物迅速放入滅菌低溫肉湯A培養(yǎng)基中帶回實驗室做病原菌的分離和鑒定，同時采集沒有患子宮內(nèi)膜炎的奶牛樣品進行對照。

2.1.2 細菌分離培養(yǎng) 將采集到的樣品接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，取一部分分別接種到血液瓊脂平板等，進行有氧和厭氧等篩選鑒定培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)物生長情況和菌落形態(tài)特征，并進行記錄，同時，挑取生長狀態(tài)不同的菌落，進行革蘭染色和鏡檢，根據(jù)菌落的染色特性并結(jié)合菌落形態(tài)和生長特征，進行涂片、火焰固定、革蘭染色后鏡檢，根據(jù)培養(yǎng)物鏡檢結(jié)果，選擇特征性菌落接種血瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，置恒溫箱72 h重新培養(yǎng)，供細菌鑒定使用。

2.1.3 細菌涂片、革蘭染色和鏡檢 火焰灼燒接種環(huán)，取少量蒸餾水于載玻片，然后取少量菌落在水中混合后涂勻，干燥后進行火焰固定，抹片上滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液1 min水洗，加革蘭碘液媒染1 min水洗，加95%酒精10～30 s水洗脫色，再滴加石碳酸復(fù)紅復(fù)染30 s水洗，自然干燥鏡檢。

2.2 細菌鑒定方法

2.2.1 細菌培養(yǎng)特性鑒定 將細菌接種培養(yǎng)基培養(yǎng)后，觀察有無菌落生長，菌落形態(tài)、大小、特征、顏色等。鏈球菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良或不生長，在血瓊脂上生長為細小光滑、扁平或突起、邊緣整齊白色菌落，進行記錄。肉湯接種培養(yǎng)后，觀察肉湯透明度、渾濁程度、是否管底有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附著物，是否出現(xiàn)菌臘膜、菌環(huán)等。

2.2.2 細菌染色鏡檢和生化鑒定 細菌涂片后，使用革蘭染色法染色，將染色后的涂片鏡檢，革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色，用以區(qū)分細菌類別。染色后進行病原體鏡檢，主要觀察細菌形態(tài)特征，根據(jù)病原菌大小、形態(tài)、有無莢膜、芽孢等特征進行細菌鑒定。對經(jīng)培養(yǎng)特性、形態(tài)學檢查初步鑒定的菌株進行進一步的生化鑒定。

3 結(jié)果

3.1 不同奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎流行病學調(diào)查結(jié)果 在做細菌分離鑒定的同時，隨機對所在8個奶牛場圍產(chǎn)期奶牛子宮內(nèi)膜炎進行了流行病學調(diào)查，結(jié)果見表1，從表1可知，在不同的規(guī)模的8個奶牛場檢測出奶牛子宮內(nèi)膜炎平均陽性率為20.26%。其中陽性率最低的是規(guī)?；B(yǎng)殖場，平均陽性率為8.76%，養(yǎng)殖小區(qū)牛場陽性率最高，達到34.57%，普通養(yǎng)殖場奶牛子宮內(nèi)膜炎的平均陽性率為28.57%。檢測結(jié)果表明，鄭州市奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎感染較為普遍，不同奶牛場子宮內(nèi)膜炎陽性率差異極顯著(P<0.01)，尤其以養(yǎng)殖小區(qū)最為嚴重，結(jié)果如圖1所示。

表1 不同奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎流行病學調(diào)查結(jié)果

圖1不同規(guī)模養(yǎng)殖場奶牛子宮內(nèi)膜炎陽性率

3.2 細菌鑒定結(jié)果 本次試驗對88份奶牛子宮內(nèi)膜炎樣品進行細菌分離鑒定，結(jié)果如表1所示，此次試驗共檢出細菌56株，革蘭陰性菌24株，革蘭陽性菌32株，結(jié)果如表3所示。檢出菌中，金黃色葡萄球菌7株，占7.95%；大腸埃希菌12株，占細菌總數(shù)的13.64%；產(chǎn)吲哚金黃桿菌、停乳鏈球菌和蘇云金芽孢桿菌各4珠，占細菌總數(shù)的4.55%；蠟樣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和乳房鏈球菌各5株，占細菌總數(shù)的5.68%；淺黃金色單胞菌3株，占細菌總數(shù)的3.41%；奧斯陸莫拉菌、成團泛菌和產(chǎn)堿假單胞菌各2珠，占細菌總數(shù)的2.27%；棒狀桿菌屬檢出1株，占檢出細菌總數(shù)的1.14%；其中，在分離出細菌的88份樣品中，大部分為混合感染。通過以上數(shù)據(jù)分析顯示，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、奧斯陸莫拉菌和蠟樣芽孢桿菌為鄭州市被檢測奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌。

表1 細菌分離鑒定結(jié)果

3.3 不同奶牛場子宮內(nèi)膜炎感染細菌的優(yōu)勢菌群 在8個不同的奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎檢測樣品中，養(yǎng)殖小區(qū)牛場檢出菌30株，金黃色葡萄球菌7株，大腸埃希菌4株，表皮葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌各3珠，產(chǎn)吲哚金黃桿菌、淺黃金色單胞菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和成團泛菌各2株，蠟樣芽孢桿菌、棒狀桿菌屬和產(chǎn)堿假單胞菌各1珠，細菌種類較雜，其優(yōu)勢菌群為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌；普通養(yǎng)殖場檢出菌共16株，其中金黃色葡萄球菌、淺黃金色單胞菌、停乳鏈球菌、表皮葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌各1珠，產(chǎn)吲哚金黃桿菌、奧斯陸莫拉菌和乳房鏈球菌各2株，大腸埃希菌和蠟樣芽孢桿菌各3株，其優(yōu)勢菌群為大腸埃希菌和蠟樣芽孢桿菌；規(guī)?；B(yǎng)殖場共檢出菌10株，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2株，淺黃金色單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、停乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌和產(chǎn)堿假單胞菌各1珠，其優(yōu)勢菌群為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，結(jié)果見表2。

4 討論

4.1 奶牛子宮內(nèi)膜炎是導(dǎo)致奶牛被淘汰的主要疾病之一，主要原因是由病原微生物感染所引起的[3]，所以本試驗的主要目的是進行病原菌的分離鑒定，同時，進行了奶牛子宮內(nèi)膜炎的流行病學調(diào)查，在不同規(guī)模的8個奶牛場檢測奶牛459頭，檢出子宮內(nèi)膜炎陽性奶牛93頭，平均頭數(shù)陽性率為20.26%。其中陽性率最低的規(guī)?；B(yǎng)殖場，平均陽性率為8.76%，養(yǎng)殖小區(qū)牛場陽性率最高，平均陽性率達到34.57%，說明奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生率與飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生條件差密切相關(guān)，飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生差的養(yǎng)殖小區(qū)要比規(guī)模化養(yǎng)殖場子宮內(nèi)膜炎感染率高，且差異極顯著(P<0.01)，說明較好的飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是預(yù)防奶牛子宮內(nèi)膜炎的必要條件。

4.2 本試驗通過對子宮內(nèi)膜炎陽性奶牛進行病原菌分離和鑒定檢測，在被確定為子宮內(nèi)膜炎患牛的陽性樣本88份，經(jīng)細菌學分離培養(yǎng)，共檢出細菌56株，革蘭陰性菌24株，革蘭陽性菌32株，從試驗結(jié)果分析可知，奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生主要是由病原微生物引起，應(yīng)加強平時對病原微生物的監(jiān)測，切斷奶牛子宮內(nèi)膜炎傳染源的傳播。

4.3 本試驗細菌學鑒定，因受各種因素的影響，只能采用綜合判定方法，本次試驗采用南京農(nóng)業(yè)大學陸承平編寫的獸醫(yī)微生物學和伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)資料中方法進行試驗，試驗結(jié)果表明，對88份乳樣進行細菌分離鑒定，共檢出細菌56株，其中有12株為金黃色葡萄球菌、7株為大腸埃希菌，說明這兩種細菌為鄭州市奶牛場奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌，這為以后子宮內(nèi)膜炎的預(yù)防提供了有力的科學依據(jù)。

表2 不同奶牛場細菌感染優(yōu)勢菌群檢測結(jié)果

4.4 奶牛子宮內(nèi)膜炎病原微生物的傳播方式可分為傳染性和環(huán)境性兩大類，圍產(chǎn)期奶牛的發(fā)病率較高，可能的原因是由于奶牛分娩過程中子宮口打開，病原微生物容易進入子宮，同時子宮內(nèi)此時有充足的血液供應(yīng)、子宮內(nèi)適宜的pH值、水分和合適的溫度[4]，為進入子宮內(nèi)的細菌繁殖提供了條件，所以奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率較高，應(yīng)加強圍產(chǎn)期奶牛的環(huán)境衛(wèi)生管理，降低病原在奶牛養(yǎng)殖間的相互傳播機率。