劉世舉 張慧儉 王金榜 楊會舉 張新春 劉翔 劉佃溫

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球發(fā)病率排名第3位的惡性腫瘤［1］，目前在中國每年新發(fā)病例約為37.5萬，死亡為19.1萬例［2-3］。基于對“IDEA”研究的認可，2018年第1版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南推薦對于低危Ⅲ期結(jié)直腸癌推薦3個月的卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑的輔助化療方案［4］。因此，CRC術(shù)后輔助化療仍是以卡培他濱為基礎(chǔ)的化療方案［5］?？ㄅ嗨麨I需要經(jīng)過3步酶聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為5-FU，其中最重要的為被胞苷脫氨酶（cytidine deaminase，CDD）和胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TYMP）代謝成5-FU而發(fā)揮細胞毒作用。5-FU的主要作用靶標為胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS），被二氫嘧啶脫氫酶（dihydropyrimidine dehydroge?nase，DPD）滅活［6］。因此，在卡培他濱代謝為5-FU過程中，CDD具有重要作用。

CDD基因位于染色體1p36.12，包含4個外顯子。該基因的表達在體內(nèi)普遍存在，主要表達于肝臟，既往研究結(jié)果表明腫瘤細胞內(nèi)較高的CDD表達水平和對卡培他濱的敏感性呈顯著正相關(guān)［7］。CDD基因-451C＞A位點在既往研究中發(fā)現(xiàn)可以影響CDD基因的活性［8］。近期在188例接受貝伐珠單抗聯(lián)合紫杉醇卡培他濱治療的晚期乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)，CDD基因-451C＞A位點的GA/AA基因型患者的客觀緩解率達到66.7%，顯著高于野生型的患者［9］。然而，目前在CRC輔助化療領(lǐng)域，尚缺乏CDD基因-451C＞A位點和預(yù)后的關(guān)聯(lián)性研究。

因此，本研究旨在評估CDD基因-451C＞A位點與接受卡培他濱為基礎(chǔ)輔助化療方案的CRC患者預(yù)后相關(guān)性，并探討該位點對外周血單核細胞中CDD基因mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料

本研究回顧性分析2010年1月至2017年6月河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治術(shù)后接受輔助化療的CRC患者215例。入組標準：1）年齡≥18歲，ECOG評分為0～2分，心功能正常（左心室射血分數(shù)＞50%），腎功能正常（肌酐≤1.5×ULN），骨髓功能正常（中性粒細胞計數(shù)≥1.5×109/L，血小板計數(shù)≥100×109/L，血紅蛋白≥9 g/dL）；2）預(yù)期壽命≥3個月。排除標準：家族性腺瘤性息肉病、其他遺傳性CRC綜合征及失訪的患者。

輔助化療的用法用量：術(shù)后3～4周，卡培他濱，1 000 mg/m2，2次/d，第1～14 d，每21 d為1個周期。奧沙利鉑，80～130 mg/m2，靜脈滴注，第1 d。輔助化療結(jié)合患者情況為6～8個周期。根據(jù)治療過程中出現(xiàn)的血液學(xué)或非血液學(xué)毒性調(diào)整相應(yīng)的給藥劑量，如發(fā)生威脅生命的不良反應(yīng)則中止治療。本研究獲得河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會的批準（批號：科研-2016-013），所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本收集及基因分型 治療過程中收集患者的外周血樣本4 mL，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，之后于-20℃保存。設(shè)計包含-451C＞A（rs532545）位點的上下游PCR引物，上游引物：5′-TCAAAGGTCC AAGCTCCAAG-3′；下游引物：5′-GGGCTAGGGCAAA GAGAAGT-3′，產(chǎn)物片段為208 bp，通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）方法對該位點進行基因分型。分析設(shè)置陰性參照，＞10%的樣本至少分析1次確保樣本未被污染，部分樣本的分型結(jié)果通過直接測序方法進行驗證。

1.2.2 外周血單核細胞提取及CDD基因mRNA表達分析 收集85例患者化療前的外周血標本，采用淋巴細胞分離液Histopaque-1077（購自美國Sigma公司）對標本進行外周血單核細胞的提取。用Trizol試劑（購自大連寶生物工程有限公司）提取PBMC中的RNA。用real-time PCR法進行CDD mRNA表達實驗，CDD基因的上游引物：5′-TGGCCCAGAAGCGT CCTG-3′；下游引物：5′-TCACTGGGTCTTCTGCAGG TCC-3′。實時定量PCR反應(yīng)體系：SYBN Premix Ex Tag溶液10 μL，TYMP F primer（20 μM）0.2 μL，TYMP R primer（20 μM）0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA2 μL，反應(yīng)體系總計20 μL，GAPDH mRNA表達用作內(nèi)參。CDD mRNA用相對定量法2-△△Ct進行計算。

1.2.3 隨訪 全部患者入組后開始隨訪，前期隨訪在患者就診醫(yī)院接受固定周期輔助化療期間進行，此階段可以明確獲取每例患者復(fù)發(fā)的原因和日期。后期對總生存期（overall survival，OS）與患者后線接受的治療情況進行電話隨訪，重點詢問死亡狀態(tài)和日期。本研究最后一次隨訪時間為2017年12月，所有患者從納入研究到最后1次隨訪的中位隨訪時間為4.21（0.5～6.1）年。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗分析多態(tài)性位點基因分型是否符合哈迪溫伯格平衡。在基線臨床資料中，離散型變量和-451C＞A位點不同基因型的分布采用χ2檢驗，當數(shù)據(jù)較少時采用Fisher精確檢驗。連續(xù)型變量和-451C＞A位點不同基因型的分析采用非參檢驗的Mann-Whitney U（兩組間）或Kruskal-Wallis H（多組間）檢驗。采用Stata 14.0軟件繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者無病生存期（disease-free survival，DFS）和OS的差異，曲線間的差異采用對數(shù)秩檢驗進行比較。DFS定義為從手術(shù)開始到疾病復(fù)發(fā)或任何原因引起死亡的時間。OS定義為從手術(shù)開始到任何原因引起死亡的時間。不良反應(yīng)的多變量分析采用二元的Logistic回歸分析，生存分析的多變量分析通過Cox風(fēng)險比例模型校正。采用向后LR的選擇步驟來篩選和校正潛在的混雜變量。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 215例患者基線臨床資料及-451C＞A位點基因分型情況

215例患者的基線臨床資料見表1。入組患者中位年齡為52歲，ECOG評分為0分的患者139例（64.65%），結(jié)腸癌和直腸癌分別為129例和86例，腫瘤分化中等患者149例（69.30%）。在臨床分期上，Ⅱ期患者57例，Ⅲ期158例。所有患者均接受術(shù)后輔助化療，其中卡培他濱單藥方案67例（31.16%），卡培他濱聯(lián)合奧沙利鉑方案148例（68.84%）。

-451C＞A位點的基因分型結(jié)果為：野生GG型157例（73.02%），GA型53例（24.65%），AA型5例（2.33%），最小等位基因頻率為0.15，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.834）。

表1 215例CRC患者的基線臨床資料及-451C>A位點基因型的基線臨床資料對比 n（%）

2.2 CDD基因-451C＞A位點和DFS及OS的關(guān)聯(lián)

-451C＞A位點突變純合子AA型患者僅5例，故后期分析將GA和AA患者合并，共計58例。野生型GG型和突變的GA/AA基因型患者在基線臨床資料上分布均衡（表1）。

對215例患者的總體數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，患者3年DFS為67.44%（95%CI：60.93%～73.49%），5年OS為58.60%（95%CI：51.21%～68.82%）。

-451C＞A位點不同基因型患者的3年DFS呈顯著性差異。攜帶A等位基因的GA/AA基因型患者和野生型GG型患者的3年DFS分別為81.03%和62.42%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002，圖1）。另外，本研究構(gòu)建Cox風(fēng)險比例模型，將可能影響DFS的風(fēng)險因素如年齡、性別、ECOG評分（1～2分歸為一組）、腫瘤分期及-451C＞A位點不同基因型納入該模型。經(jīng)過多變量校正，-451C＞A位點對DFS獨立的影響意義依然存在，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（OR=0.55，P=0.011）。在Cox模型中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的變量還有 ECOG 評分（OR=1.88，P=0.009）和腫瘤分期（OR=2.95，P＜0.001）（表2）。

圖1 215例CRC患者中CDD基因-451C＞A位點不同基因型患者的DFS曲線

表2 影響DFS的基線臨床資料以及多態(tài)性位點的多變量Cox回歸分析

在針對OS的單因素變量分析中，兩組基因型患者OS呈顯著性差異，GA/AA基因型患者和GG基因型患者的5年OS率分別為72.41%和53.50%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016，圖2）。

圖2 215例CRC患者中CDD基因-451C＞A位點不同基因型患者的OS曲線

本研究對手足綜合征（hand foot syndrome，HFS）的發(fā)生情況進行分析，結(jié)果表明215例患者中出現(xiàn)2級及以上HFS患者為67例（31.16%）。GA/AA基因型患者中2級及以上HFS的發(fā)生率為44.83%，GG基因型患者中發(fā)生率為26.11%。GA/AA基因型患者中HFS的發(fā)生率顯著高于GG型患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009）。

2.3 -451C＞A位點對CDD基因mRNA表達的影響

本研究納入85例從患者的外周血單核細胞標本，通過提取的RNA對CDD的mRNA表達情況進行分析，并和-451C＞A位點的基因型進行相關(guān)性分析。在85例PBMC標本中，GG型62例，GA型21例，AA型2例，3種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.889）。AA型患者相對較少，將AA型和GA型患者合并，共計23例。攜帶A等位基因的GA/AA型患者相對于GG型患者，CDD mRNA表達水平明顯較高（3.02±0.16vs.2.33±0.32），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

圖3 CDD基因-451C＞A位點不同基因型患者的相對CDD mRNA表達

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)-451C＞A位點野生型GG基因型患者相較于攜帶A等位基因的GA和AA基因型患者具有顯著較差的DFS和OS，并發(fā)現(xiàn)不同基因型患者的CDD基因mRNA表達水平呈較大的差異。-451C＞A位點可能通過影響CDD基因的表達使CRC患者從卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療中獲益。

本研究215例患者3年DFS率為67.44%（95%CI：60.93%～73.49%），5年OS率為58.60%（95%CI：51.21%～68.82%），低于NO.16968研究的3年DFS為70.9%和 5年 OS為 77.6%［10］，可能因為本研究中ECOG評分為0分的患者比例低于NO.16968研究（64.65%vs.77.00%）?？赡芤驗榛仡櫺苑治鱿鄬τ谠O(shè)計嚴謹、給藥方案規(guī)范的Ⅲ期臨床研究的療效較低，本研究結(jié)果與張德志等［11］的研究結(jié)果相符。

另外，本研究中57例Ⅱ期結(jié)直腸癌患者是否能從卡培他濱為基礎(chǔ)的化療方案治療中獲益，目前尚存爭議，在Ⅱ期具有MSI-H/d-MMR的患者中未能從氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的輔助化療當中獲益，這部分患者可能在Ⅱ期患者中的分布頻率只有不到20%［12］。

本研究結(jié)果表明，部分中國CRC患者接受卡培他濱為基礎(chǔ)的輔助化療方案時，CDD基因-451C＞A位點的A等位基因攜帶者可通過影響該基因的表達，使得該基因型患者對卡培他濱更為敏感，進而從卡培他濱的輔助化療中獲益。本研究結(jié)果與Lam等［9］的研究結(jié)果相符，該研究納入188例接受紫杉醇、卡培他濱聯(lián)合貝伐珠單抗治療的晚期乳腺癌患者，通過對CDD基因-451C＞A等位點進行基因分型并和療效進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了該位點GA/AA基因型患者具有顯著較高的客觀緩解率和顯著較長的中位無進展生存期。但是該研究并未進一步分析該位點和CDD基因表達及活性的關(guān)聯(lián)。另外，Caronia等［13］的一項研究納入130例接受卡培他濱治療的CRC和乳腺癌患者，結(jié)果表明在高加索人群中-451C＞A位點的等位基因頻率達到0.30，而本研究中該位點僅為0.14，說明該位點具有較大的種族差異。該研究表明，-451C＞A位點的A等位基因攜帶者具有顯著較高的3級HFS發(fā)生率，與本研究結(jié)果一致。既往的研究結(jié)果提示，出現(xiàn)3級HFS的患者具有較好的預(yù)后［14］。然而，在表達分析中并未發(fā)現(xiàn)該位點和CDD基因mRNA表達的相關(guān)性，與本研究結(jié)果不一致，可能是因為該位點存在較大的種族差異。本研究基因表達的結(jié)果也可以部分解釋CDD基因-451C＞A多態(tài)性位點具有較好預(yù)后的原因：GA/AA基因型的個體通過引起CDD mRNA的高表達從而在卡培他濱代謝過程中更多地代謝為5-FU，進而使患者從卡培他濱的術(shù)后輔助化療中獲益。

綜上所述，本研究結(jié)果表明在部分中國CRC人群中CDD基因-451C＞A位點是一個獨立的DFS影響因素。本研究也存在部分局限性，首先，納入研究的樣本量較小。其次，作為回顧性分析，無法避免偏倚。然而，本研究對-451C＞A位點的預(yù)后影響進行了較為充分的評估，也從CDD基因mRNA表達層面揭示了該位點造成預(yù)后差異的可能因素，對結(jié)直腸癌術(shù)后輔助卡培他濱為基礎(chǔ)化療方案的患者預(yù)后評估具有一定的參考價值。亟需大樣本前瞻性臨床研究進一步驗證。