張瑞霞，李海峰，馮迎娥，李靜

（1.河南省安陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000；2.河南省安陽(yáng)市湯陰縣五陵鎮(zhèn)人民政府，河南 安陽(yáng) 455000）

近年來(lái)南瓜作為一種具有天然營(yíng)養(yǎng)與保健功能的蔬菜，得到了人們?cè)絹?lái)越多的重視，特別是對(duì)于南瓜育種的研究。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)育種的不斷發(fā)展，常規(guī)育種的不足在實(shí)際工作中日漸明顯，而單倍體育種因其能通過(guò)直接加倍得到純合二倍體受到了科研工作者的青睞。南瓜為異交植物，天然雜交率高，在常規(guī)育種中利用自交的方法獲得一個(gè)純系需要多代繁育，從而使育種、雜種一代的利用和良種繁育工作加長(zhǎng)了周期和應(yīng)用年限，而單倍體育種正好可以彌補(bǔ)這點(diǎn)不足，但由于影響因素較多，所以單倍體育種還未得到廣泛的應(yīng)用。為了進(jìn)一步加快南瓜育種進(jìn)程以及使單倍體育種應(yīng)用于南瓜生產(chǎn)，本試驗(yàn)以葫蘆科南瓜屬中的南瓜優(yōu)選自交系10-4-25的花藥為試驗(yàn)材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，旨在對(duì)影響南瓜花藥培養(yǎng)的因素及培養(yǎng)中出現(xiàn)的褐變、污染現(xiàn)象作初步研究，從而為南瓜屬蔬菜單倍體育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為南瓜優(yōu)選自交系10-4-25（100粒種子），由安陽(yáng)市農(nóng)科院提供。于2017年春季定植于安陽(yáng)農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

選用MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基，兩種培養(yǎng)基均附加蔗糖3%、瓊脂0.6%以及外源激素NAA、6-BA、2,4-D，pH值均為5.8。其中MS-N培養(yǎng)基配制時(shí)去掉了NH4NO3、KNO3等元素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)了9組激素配比方案，進(jìn)行最優(yōu)激素組合試驗(yàn)，每組5個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.2 花藥消毒與接種

試驗(yàn)采用0.1%HgCl2和2%次氯酸鈉兩種消毒劑對(duì)南瓜花藥進(jìn)行消毒處理。從田間采集南瓜花蕾（長(zhǎng)2.93cm、粗0.89cm），將花蕾置于黑暗條件下，分別低溫（4℃）預(yù)處理24h和48h。用75%酒精浸泡30s后，取出用無(wú)菌水清洗1～2次，放入0.1%HgCl2中消毒7min或放入2%次氯酸鈉中消毒10min，然后取出再用無(wú)菌水沖洗4～5次。在無(wú)菌條件下，剝?nèi)セò辏瑢⒒ㄋ幏謩e接種于預(yù)先配制好的MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)花蕾的花藥。接種方式為將花藥平放于培養(yǎng)基上，讓花藥與培養(yǎng)基充分接觸?；ㄋ幗臃N后，放入培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～28℃，培養(yǎng)3d后開(kāi)始觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒試劑、消毒方法對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

在南瓜花藥培養(yǎng)中，只有滅菌徹底才能將培養(yǎng)工作進(jìn)行下去。前人的工作大多是采用0.1%HgCl2滅菌，由于南瓜花蕾大，且雨后采集的花蕾更易受污染。本試驗(yàn)對(duì)比了不同消毒劑、消毒方法對(duì)花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1無(wú)論采用何種消毒劑，用手剝?nèi)』ㄋ幭镜母腥韭首罡?，直接消毒花藥的次之，用刀劃開(kāi)花蕾取出花藥消毒的最低。另外，0.1%HgCl2消毒7min，污染率高，且效果較差；用2%次氯酸鈉消毒10min，污染率低消毒效果也較好。

2.2 培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

不同培養(yǎng)基對(duì)花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2（見(jiàn)下頁(yè)）。由表可以看出：MS培養(yǎng)基出現(xiàn)愈傷的效果好于MS-N培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基的褐變率高于MS-N培養(yǎng)基，為50.7%，MS-N培養(yǎng)基雖然褐變率相對(duì)較低，但是卻發(fā)現(xiàn)接種后的花藥出現(xiàn)了直接發(fā)白死亡的現(xiàn)象。初步分析，這種現(xiàn)象可能是培養(yǎng)基中缺少有利于植物生長(zhǎng)的氮元素的緣故。這方面的研究工作還有待于進(jìn)一步的深入。

表1 不同消毒試劑、消毒方法的比較Table 1 Comparison of different disinfection reagents and disinfection methods

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)花藥的影響Table 2 Effect of different media on anther

表3 不同培養(yǎng)組合對(duì)花藥的影響Table 3 Effects on anther of different culture combinations

2.3 不同培養(yǎng)基組合的影響

試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了9組試驗(yàn)組合。試驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)實(shí)際條件設(shè)計(jì)了每組5個(gè)培養(yǎng)皿，共45個(gè)培養(yǎng)皿，且每組的前2個(gè)培養(yǎng)皿所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，后3個(gè)培養(yǎng)皿為MS-N培養(yǎng)基。

根據(jù)表3的9組組合方案兩種培養(yǎng)基進(jìn)行花藥培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明：組合5的方案較好，接種于MS和MS-N培養(yǎng)基上的花藥均出現(xiàn)了愈傷（但隨后該愈傷發(fā)生了褐化死亡），按其他組合方案將花藥接種于不同的培養(yǎng)基后雖也有個(gè)別愈傷出現(xiàn)，但總體表現(xiàn)為不同程度的褐化現(xiàn)象，這可能與培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度有關(guān)。

2.4 外植體不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)花藥培養(yǎng)的影響

表4顯示了不同預(yù)處理方法對(duì)南瓜花藥的影響，由表4可知，經(jīng)低溫（4℃）預(yù)處理24h、48h后，用南瓜花藥進(jìn)行培養(yǎng)，都能出現(xiàn)一定的膨大現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)低溫預(yù)處理24h和未經(jīng)任何預(yù)處理的花藥獲得的愈傷組織誘導(dǎo)率基本上為0。48h的低溫預(yù)處理，經(jīng)過(guò)12d的培養(yǎng)后，有4個(gè)花藥長(zhǎng)出了愈傷組織。隨著培養(yǎng)時(shí)間地延長(zhǎng)，膨大后的花藥逐漸變褐，其中有些花藥接種后直接發(fā)白死亡。

由此可以看出，處理時(shí)間越長(zhǎng)，誘導(dǎo)率越高，但是褐化也越嚴(yán)重。因此要注意選擇適宜的預(yù)處理時(shí)間，從而來(lái)提高外植體的存活率。

表4 不同預(yù)處理對(duì)花藥的影響Table 4 Effects of different pretreatment on anther

花藥在離體培養(yǎng)前進(jìn)行低溫預(yù)處理，適宜的低溫預(yù)處理可以提高愈傷組織和胚狀體的形成，并進(jìn)一步促進(jìn)植株的再生。在4℃低溫條件下，分別進(jìn)行預(yù)處理24h、48h以及未經(jīng)任何預(yù)處理3種方案的研究表明，4℃、48h的預(yù)處理方式中發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基和MS-N培養(yǎng)基中均出現(xiàn)了花藥愈傷組織，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，花藥逐漸變褐，直至死亡。因此，對(duì)于低溫預(yù)處理的合適時(shí)間和合適溫度尚待繼續(xù)深入研究。

3 小結(jié)

3.1 南瓜花藥培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)率偏低

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，不同的材料、不同的培養(yǎng)基中南瓜花藥總體誘導(dǎo)率還是比較低的，這是一個(gè)普遍問(wèn)題，也是現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的主要研究方向[4,5]。對(duì)于本試驗(yàn)，材料是一個(gè)花培中未曾研究的新基因型，因此，對(duì)培養(yǎng)基、附加成份的反應(yīng)都是不確定因素，盡管我們也篩選了提高南瓜花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導(dǎo)頻率的激素種類和激素組合，但其最高誘導(dǎo)率仍不到1%，因此，這方面的技術(shù)還有待于進(jìn)一步的探討。

3.2 南瓜花藥培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象普遍

花藥培養(yǎng)中的褐化問(wèn)題一直以來(lái)都是相當(dāng)普遍的，一般來(lái)說(shuō)，外植體材料中單寧類和多種羥酚類化合物含量高的品種易引起褐化。試驗(yàn)表明，MS培養(yǎng)基的褐變率高于MS-N培養(yǎng)基，為50.7%，這可能與培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度等有關(guān)，因此，在初培養(yǎng)階段，應(yīng)該注意選擇適宜的無(wú)機(jī)鹽成分、蔗糖濃度和激素濃度。另外，正確選擇消毒劑濃度及消毒時(shí)間，也能保證較高的外植體存活率[6]。