劉芳潔

(晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600

蘋果(Malusdomestica)屬薔薇科蘋果屬多年生植物，富含人體所需的礦物質(zhì)及維生素，深受人們歡迎，已成為世界四大水果之一[1]。蘋果樹腐爛病(ValsamaliMiyabe et Yamada)別稱臭皮病、爛皮病，是一類由黑腐皮殼屬真菌引起的真菌型病害，具有發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重及難治愈等特點，是影響蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的重要限制因素[2-3]。蘋果園一旦發(fā)生腐爛病，輕者造成蘋果減產(chǎn)，重者果樹大量死亡甚至毀園，會給果農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，已成為威脅我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害[4]。目前，在生產(chǎn)上常用化學(xué)藥劑進(jìn)行蘋果樹腐爛病的田間防治，常用藥劑主要有多菌靈藥泥[5]、戊唑醇[6]、氟硅唑[7]及甲硫·萘乙酸[8]等，均取得了不錯的防治效果。但是，由于化學(xué)藥劑的大量、長期使用不僅對人體健康造成了嚴(yán)重威脅，而且常造成環(huán)境污染和病原菌的抗藥性，因此，開發(fā)環(huán)境友好型生物制劑來高效防治蘋果樹腐爛病已成為當(dāng)前蘋果生產(chǎn)中亟須解決的關(guān)鍵問題[9]。

紫蘇(PerillafrutescensL.)別稱赤蘇、白蘇，屬一年生唇形科紫蘇屬草本植物，在我國常作為藥食兼用作物進(jìn)行栽培[10]。大量研究表明，紫蘇富含黃酮類、苷類、萜類及揮發(fā)油類等成分，具有抑菌、抗氧化、降脂降糖等生物活性[11-12]。程道梅等研究表明，紫蘇乙醇提取物具有較廣的抑菌譜，能夠較好地抑制食品中常見的細(xì)菌、霉菌及酵母菌，是一種較好的生物抑菌劑[13]；郝佳等研究表明，紫蘇葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制能力，可作為抗菌藥物進(jìn)行開發(fā)利用[14]；段江蓮等研究表明，紫蘇葉部位的多酚及黃酮含量顯著高于其他部位，葉部位甲醇提取物可明顯抑制敏感菌株大腸桿菌的生長，是一種優(yōu)良的天然防腐劑和抗氧化劑[15]；魏雯等研究表明，紫蘇葉、籽皮水浸液對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌及金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，其中，對枯草芽孢桿菌的抑菌作用最強(qiáng)[16]。然而，關(guān)于紫蘇乙醇提取物對植物病原菌抑制及提供植物抗病性方面的研究尚未見相關(guān)報道。因此，本研究以富士幼樹為對象，分析紫蘇不同部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行了初步研究，以期為蘋果樹腐爛病的生物防治及紫蘇資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蘋果樹品種為富士幼樹，購自山西省晉中市種苗站；供試紫蘇品種為奇蘇1號，由筆者所在課題組自主種植；供試蘋果樹腐爛病病原菌由筆者所在課題組自主分離保存，經(jīng)鑒定為黑腐皮殼屬(Valsamali)真菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 試驗于2017年4月在晉中職業(yè)技術(shù)學(xué)院實驗室開始實施，紫蘇莖、葉、花及籽部位的乙醇提取物及腐爛病病原菌抑制試驗參照程道梅等[13]方法進(jìn)行；將抑菌效應(yīng)最佳的紫蘇葉片乙醇提取物濃度分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)試驗，具體參照任艷芳等的方法[17]進(jìn)行。選取長勢一致的富士蘋果幼苗120株，分別定植于50 cm×55 cm的陶盆中，盆栽基質(zhì)為改良的土壤基質(zhì)，每盆定植1株，正常水肥管理；田間預(yù)防試驗分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物進(jìn)行枝條涂抹，25 mL/株，重復(fù)3次，每次間隔3 d，對照為同體積的蒸餾水涂抹；第3次涂抹完成后3 d，在樹皮上接種腐爛病菌，接種量為2.0×106CFU/g，每個處理重復(fù)10株，共60株，隨機(jī)排列。田間治療試驗首先進(jìn)行病原菌接種，具體方法與預(yù)防試驗一致。接菌后3 d分別用濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物進(jìn)行枝條涂抹，具體方法與預(yù)防試驗完全一致。選取預(yù)防試驗中的各處理植株進(jìn)行生理及分子指標(biāo)測定，每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 生理指標(biāo)及測定方法 采用任艷芳等[17]的方法進(jìn)行病原菌抑制率測定。抑制率(I)計算公式為I=(DO-DL)/DL×100%，式中DO表示對照菌落直徑；DL表示處理菌落直徑。自接種腐爛病病原菌5 d后起開始調(diào)查，每隔5 d調(diào)查1次，按趙仕光等方法[18]進(jìn)行病情指數(shù)、發(fā)病率及防治效果計算；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，多酚氧化酶(PPO)活性測定參照趙仕光等的方法[18]進(jìn)行，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性采用苯丙氨酸比色法進(jìn)行測定，β-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性參照湯章城等的方法[19]進(jìn)行測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法進(jìn)行測定；脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸提取法進(jìn)行測定。

1.2.3 病程相關(guān)蛋白基因PR5和PR8表達(dá)量測定方法 蘋果樹樹皮總RNA提取按照柱式植物總RNA提取試劑盒方法進(jìn)行；RNA提取質(zhì)量用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，濃度定量用核酸分析儀進(jìn)行；以提取的蘋果樹樹皮總RNA為模板，運用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為2 μL cDNA、10 μL SYB Premix ExTaq(Tli NaseH Plus)、0.2 μmol/L上下游引物各0.4 μL、ROX Reference Dye II 0.4 μL、滅菌蒸餾水6.8 μL，在Light Cycler?480II PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)。采用2-ΔCT法計算基因相對表達(dá)量，每個處理重復(fù)3次。病程相關(guān)蛋白基因PR5、PR8及內(nèi)參基因EF1α的引物序列參照Liu等的報道進(jìn)行合成[20]，具體序列見表1。

表1 病程相關(guān)蛋白基因與內(nèi)參基因的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)整理、計算及作圖，差異顯著性分析采用SPSS 18.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇不同部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的抑菌效果

如圖1-A所示，在0.1 g/mL紫蘇莖、葉、花、籽4個不同部位乙醇提取物的處理下，蘋果樹腐爛病病菌的抑制率分別為51.17%、74.16%、65.51%、55.06%，其中葉部位抑制率較花部位達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較莖、籽部位均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，紫蘇乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的生長存在明顯抑制，且不同部位抑制率存在顯著差異，紫蘇葉部位抑制率最強(qiáng)。不同濃度紫蘇葉部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的抑制率如圖1-B所示，隨著紫蘇葉部位乙醇提取物濃度的升高，蘋果樹腐爛病病菌的抑制率呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。紫蘇葉部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.8 g/mL，抑制率較質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6 g/mL紫蘇葉片乙醇提取物處理分別提升81.38%、26.09%、15.55%、5.19%，較 0.6 g/mL 紫蘇葉片乙醇提取物處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較0、0.2、0.4 g/mL處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，不同濃度的紫蘇葉部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的抑制率存在顯著差異，其中以0.8 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物處理抑菌效果最佳。

2.2 紫蘇葉片乙醇提取物對蘋果樹腐爛病發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果的影響

由表2可知，在預(yù)防處理與治療處理中，不同濃度紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著降低蘋果樹幼苗腐爛病的病情指數(shù)和發(fā)病率(P<0.05)，防治效果顯著提高(P<0.05)。在預(yù)防處理與治療處理中均以質(zhì)量濃度為0.8 g/mL處理的紫蘇葉片乙醇提取物處理效果最佳，較0、0.2、0.4、0.6 g/mL預(yù)防處理的發(fā)病率分別降低 74.81%、33.26%、19.87%、9.33%，較0、0.2、0.4、0.6 g/mL預(yù)防處理的防治效果分別提升81.15%、46.27%、23.58%、9.89%，較0.6 g/mL預(yù)防處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較0、0.2、0.4 g/mL預(yù)防處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)；較0、0.2、0.4、0.6 g/mL治療處理的發(fā)病率分別降低62.56%、31.93%、16.82%、5.27%，較0、0.2、0.4、0.6 g/mL治療處理的防治效果分別提升76.26%、48.21%、26.88%和10.37%，較0.6 g/mL治療處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較0、0.2、0.4 g/mL 治療處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著降低蘋果樹幼苗腐爛病的發(fā)病率(P<0.05)，顯著提升防治效果(P<0.05)，且以0.8 g/mL處理效果最佳，其原因可能是由于0.8 g/mL處理紫蘇葉部位乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的抑菌效果最佳所致。

表2 紫蘇葉片乙醇提取物對蘋果樹腐爛病的影響

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 紫蘇葉片乙醇提取物對蘋果樹樹皮防御酶活性的影響

紫蘇葉片乙醇提取物對蘋果樹樹皮防御酶活性的影響如圖2所示，隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高，蘋果樹樹皮的POD、PPO、PAL及GLU活性均呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢；隨著處理時間的延長，蘋果樹樹皮的POD、PPO、PAL及GLU活性均呈先上升后急劇下降的趨勢。不同濃度紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著提升蘋果樹樹皮的POD、PPO、PAL及GLU活性，且以0.8 g/mL處理提升幅度最大。在接種后20 d，各處理的POD、PPO、PAL及GLU活性均達(dá)到最高，質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL處理的紫蘇葉片乙醇提取物處理的蘋果樹樹皮POD活性分別是對照的1.88、2.02、2.14、2.41、2.39倍，PPO活性分別是對照的1.20、1.31、1.46、1.64、1.63倍，PAL活性分別是對照的1.67、1.92、2.12、2.31、2.31倍，GLU活性分別是對照的1.36、1.54、1.84、2.29、2.29倍，其中0.8 g/mL處理紫蘇葉片乙醇提取物處理的POD、PPO、PAL及GLU活性較0.6 g/mL處理達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，較CK、0.2、0.4 g/mL處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，紫蘇葉片乙醇提取物處理可提升蘋果樹樹皮的防御酶活性，且以質(zhì)量濃度為 0.8 g/mL 處理提升幅度最大。

2.4 紫蘇葉片乙醇提取物對蘋果樹樹皮丙二醛及游離脯氨酸含量的影響

如圖3-A所示，隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高，蘋果樹樹皮的MDA含量呈逐漸降低的趨勢；隨著處理時間的延長，蘋果樹樹皮的MDA含量呈逐漸上升的趨勢。不同濃度紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著降低蘋果樹樹皮的MDA含量，且以1.0 g/mL處理降低幅度最大。在接種后 30 d，各處理的MDA含量均達(dá)到最高，質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物處理的蘋果樹樹皮MDA含量分別較對照降低13.02%、15.03%、17.45%、19.64%和20.48%，其中1.0 g/mL的處理較 0.6 g/mL 處理達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，較0.2、0.4 g/mL 及CK處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，紫蘇葉片乙醇提取物處理可明顯降低蘋果樹樹皮的MDA含量，且以質(zhì)量濃度為1.0 g/mL處理時降低幅度最大。

紫蘇葉片乙醇提取物對蘋果樹樹皮游離脯氨酸含量的影響如圖3-B所示，隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高，蘋果樹樹皮的游離脯氨酸含量呈先上升后降低的趨勢；隨著處理時間的延長，蘋果樹樹皮的游離脯氨酸含量則呈逐漸上升的趨勢。不同濃度紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著提升蘋果樹樹皮的游離脯氨酸含量，且以0.8 g/mL處理提升幅度最大。在接種后30 d，各處理的游離脯氨酸含量均達(dá)到最高，質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物處理的蘋果樹樹皮游離脯氨酸含量分別較對照提升 13.53%、17.31%、22.27%、30.78%、23.03%，其中 0.8 g/mL的處理較0.6 g/mL處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較0.2、0.4 g/mL及CK處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，紫蘇葉片乙醇提取物處理可提升蘋果樹樹皮的游離脯氨酸含量，且以質(zhì)量濃度為0.8 g/mL處理提升幅度最大。

2.5 紫蘇乙醇提取物對蘋果樹病程相關(guān)蛋白基因PR5和PR8表達(dá)量的影響

由圖4可知，蘋果樹樹皮病程相關(guān)蛋白基因PR5和PR8的表達(dá)量隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高和處理時間的延長均呈先升高后降低的趨勢。不同濃度紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著提升蘋果樹樹皮PR5和PR8的表達(dá)量，且以 0.8 g/mL 處理提升幅度最大。在接種后20 d，各處理PR5和PR8的表達(dá)量均達(dá)到最高，質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物處理的蘋果樹樹皮PR5表達(dá)量分別是對照的1.76、2.03、2.29、2.62、2.38倍，其中 0.8 g/mL 的處理較0.6 g/mL處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較0.2、0.4 g/mL及CK處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。處理20 d后，質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 g/mL的紫蘇葉片乙醇提取物處理的蘋果樹樹皮PR8表達(dá)量分別是對照的1.63、1.77、2.01、2.29和2.12倍，其中0.8 g/mL處理較0.6 g/mL處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較0.2、0.4 g/mL 及CK處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。這說明，紫蘇葉片乙醇提取物處理可誘導(dǎo)蘋果樹樹皮的病程相關(guān)蛋白基因PR5和PR8轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，且以質(zhì)量濃度為 0.8 g/mL 處理提升幅度最大。

3 結(jié)論與討論

紫蘇體內(nèi)含有大量的黃酮類、苷類、萜類及揮發(fā)油類等生物活性成分，具有抑菌、抗氧化、降脂降糖等生物活性[11-12]。段江蓮等研究表明，紫蘇葉片多酚及黃酮成分含量明顯高于莖、花、籽部位，甲醇提取物對敏感菌株大腸桿菌具有較好的抑菌性，可以用于天然防腐劑和抗氧化劑的開發(fā)[15]；魏雯等研究表明，紫蘇葉、籽皮水浸液可較好地抑制大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、八疊球菌及金黃色葡萄球菌的生長，其中，對枯草芽孢桿菌的抑菌作用最強(qiáng)[16]。本研究結(jié)果表明，紫蘇乙醇提取物對蘋果樹腐爛病病菌的生長存在明顯抑制，且不同部位抑制率存在顯著差異，紫蘇葉部位抑制率最強(qiáng)，最小抑菌質(zhì)量濃度為0.8 g/mL，抑制率達(dá)到81.38%。在預(yù)防處理與治療處理中，不同濃度紫蘇葉片乙醇提取物處理均可顯著降低蘋果樹幼苗腐爛病的病情指數(shù)和發(fā)病率(P<0.05)，顯著提升防治效果(P<0.05)，以0.8 g/mL處理效果最佳，分別較CK、0.2、0.4 g/mL處理達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，較0.6 g/mL處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)。其原因可能是紫蘇乙醇提取物可顯著抑制蘋果樹腐爛病的病原菌，尤其以0.8 g/mL處理抑菌效果最為顯著。

植物在長期的進(jìn)化過程中，自身形成了一套完整的防御酶系統(tǒng)，以抵御生物和非生物逆境對自身造成的傷害[21]。本研究結(jié)果表明，隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高，接種蘋果樹腐爛病病原菌樹皮的POD、PPO、PAL及GLU活性均呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。其中以0.8 g/mL處理防御酶活性提升幅度最大，在接種后20 d，POD、PPO、PAL及GLU活性分別為對照的2.41、1.64、2.31和2.29倍，較0.6 g/mL處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，較CK、0.2、0.4 g/mL處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。本研究結(jié)果與周寶利等在茄子及王遠(yuǎn)遐等在黃瓜方面的研究結(jié)果[22-23]一致。MDA含量是衡量膜質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高，蘋果樹樹皮的MDA含量呈逐漸降低的趨勢，以1.0 g/mL處理效果最佳，在接種后30 d，MDA含量較CK降低20.48%，較 0.6 g/mL 處理達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)，較0.2、0.4 g/mL 及CK處理均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)，而與 0.8 g/mL 處理差異不顯著(P>0.05)。這說明，1.0、0.8 g/mL 紫蘇葉片乙醇提取物處理的蘋果樹樹皮細(xì)胞膜受破壞程度最輕，其原因是0.8、1.0 g/mL處理下蘋果樹樹皮的防御酶活性較高。

相關(guān)研究表明，PR蛋白與植物抵御病原菌侵染和抵抗非生物逆境能力密切相關(guān)[24]。本研究結(jié)果表明，PR5和PR8的表達(dá)量隨著紫蘇葉片乙醇提取物濃度的升高和處理時間的延長均呈先上升后降低的趨勢，且以0.8 g/mL處理上調(diào)表達(dá)幅度最大，分別是CK的2.62、2.29倍，與0.6 g/mL處理達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)，與0.2、0.4 g/mL及CK均達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。

綜上所述，0.8 g/mL紫蘇葉部位乙醇提取物對黑腐皮殼屬真菌抑菌性最強(qiáng)，可明顯降低蘋果樹腐爛病病情指數(shù)和發(fā)病率，防治效果顯著提升，蘋果樹防御酶活性顯著提升，病程相關(guān)蛋白基因PR5和PR8表達(dá)量顯著上調(diào)，游離脯氨酸含量顯著提升，膜質(zhì)過氧化程度顯著降低，可明顯增強(qiáng)蘋果樹對腐爛病的抗性，可用于蘋果樹腐爛病的生物防治。