鄔珊珊徐璐瑤朱佳慧王靈杰錢煜峰毛紅嬌張云嚴明

1紹興文理學院醫(yī)學院（浙江紹興312000）

2杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院（浙江杭州310018）

假體翻修術(shù)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，經(jīng)過長期磨損、碰撞會產(chǎn)生大量的聚乙烯（polyeth?ylene，PE）、金屬鈦（titanium，Ti）和陶瓷磷酸三鈣（tri?calcium phosphate，TCP）等磨損顆粒，這些顆粒會刺激假體周圍單核/巨噬細胞、成骨細胞和成纖維細胞等細胞產(chǎn)生大量的炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和前列腺素E2（PGE2），誘導破骨細胞的生成及骨溶解[1，2]。假體周圍除了含有上述組織細胞外，還存在著豐富的骨細胞（os?teocyte），其數(shù)量占骨組織細胞90%～95%。骨細胞均勻分布于礦化的骨基質(zhì)中，能通過其豐富的偽足彼此連接形成骨細胞網(wǎng)絡，維持自身生理功能，合成并分泌DMP-1及SOST等分子調(diào)控骨表面的成骨細胞和破骨細胞活動而影響骨重建[3，4]。因此，骨細胞是調(diào)控骨新陳代謝的主要細胞。

以往研究和我們前期實驗表明磨損顆粒可誘導假體周圍骨細胞凋亡，釋放TNF-α和核因子κ B受體活化因子配體（RANKL），后者促進破骨細胞活化與骨溶解，而且假體周圍骨細胞凋亡先于破骨細胞的活化[5]，因此，關(guān)節(jié)假體植入后所產(chǎn)生的磨損顆粒能誘導骨細胞受損、凋亡，成為假體周圍骨溶解的重要啟動者。此外，2016年Wang等[6]報道磨損顆?？烧T導骨細胞自噬，促進破骨細胞生成和骨吸收。以上研究結(jié)果表明：磨損顆?？烧T導假體周圍骨細胞凋亡和自噬，促進骨假體周圍溶解。

有證據(jù)顯示細胞凋亡、自噬與氧化應激密切相關(guān)[7，8]，但是氧化應激在磨損顆粒誘導的假體周圍骨細胞凋亡和自噬中的作用如何？目前尚不清楚。本研究應用前期成功構(gòu)建的TCP磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型，模擬體內(nèi)關(guān)節(jié)假體釋放的磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解和無菌性松動病理過程[2]，以小鼠顱骨溶解部位周圍骨細胞為研究對象，應用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）探討氧化應激對TCP磨損顆粒誘導假體周圍骨細胞凋亡和自噬中的影響，為防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供新的靶細胞和治療靶點。

1 材料和方法

1.1 小鼠顱骨溶解模型的構(gòu)建[2]與實驗分組

ICR雄性小鼠36只，體重18～22 g，清潔級，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心（動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001，合格證號1603090018）。實驗前將動物置室內(nèi)適應性飼養(yǎng)1周，溫度22°C～24°C，相對濕度50%～70%，動物自由進食進水，自然晝夜節(jié)律光照。

隨機分為正常組、TCP磨損顆粒（TCP）組和N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）組，每組12只。除正常組外，TCP組和NAC組小鼠分別經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉小鼠后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm，分離皮下組織，露出面積為1 cm×1 cm方形顱骨區(qū)域，取TCP磨損顆粒30 mg置于小鼠顱骨中縫骨膜上縫合皮膚構(gòu)建小鼠顱骨溶解模型。NAC處理組小鼠于術(shù)后第2天顱頂皮下注射NAC（1.0 mg/kg），2天1次。持續(xù)干預2周后處死動物取血清和顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域）。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 HE染色

每組取6只小鼠顱骨，經(jīng)10%甲醛固定48 h和10%EDTA（pH7.4）脫鈣2周后進行石蠟包埋，后經(jīng)切片機對顱骨矢狀面連續(xù)切片（5 μm），脫蠟后行HE染色。每只小鼠顱骨隨機選取4張切片置于IX70顯微鏡下觀察3個視野中假體周圍骨細胞活性及死亡（即空骨陷窩）情況變化，應用Image Pro-Plus 6.0（美國MediaCy?bernetics公司）軟件分析單位面積內(nèi)空骨陷窩數(shù)目。

1.3.2 ELISA法檢測血清骨細胞特征蛋白SOST和DMP- 1水平

各組小鼠分別于實驗結(jié)束后眼球采血1.0 mL置于EP管中，待血液凝固后于3000 r/min（4°C）離心10 min，取上清液即為血清。利用牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（DMP-1）和硬化蛋白（SOST）試劑盒檢測小鼠血清中DMP-1和SOST水平。

1.3.3 骨細胞的獲取

參照方法分離骨細胞[9]。每組取6只小鼠顱骨，去除軟組織和骨膜后，與0.2%IV型膠原酶溶液（含70 mM NaCl，10 mM NaHCO3，60 mM sorbitol，30 mM KCl，3 mM K2HPO4，1 mM CaCl2，0.1%bovine serum albumin，0.5%glucose和25 mM HEPES）在37°C培養(yǎng)箱中孵育20 min。去除上清液，顱骨碎片在37°C與含5 mM EDTA和0.1%BSA消化液中消化20 min，中間吹打1次。PBS沖洗后，重復以上消化步驟4次，收集最后2步消化后的上清液含有大量的骨細胞。

1.3.4 流式細胞術(shù)檢測骨細胞細胞凋亡及ROS水平

各組骨細胞重懸于適量PBS中，制成單細胞懸液，分別加入TUNEL（5 μL/管）或DCFH-DA（2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽，10 μmol/L），避光孵育15～30 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞內(nèi)ROS水平[5]。

1.3.5 骨細胞蛋白提取和比色法檢測假體周圍骨細胞MDA含量和SOD活性

各組骨細胞加入RIPA（100 μL）裂解液置于冰上裂解30 min。經(jīng)12000 r/min離心15 min收集上清液即為總蛋白，通過BCA?試劑盒檢測各組總蛋白濃度。利用丙二醛（MDA）和SOD試劑盒檢測各組骨細胞中MDA含量和SOD活性的變化。

1.3.6 Westernblot檢測蛋白表達[10]

各組骨細胞蛋白提取液加入上樣緩沖液后煮沸10 min，冷卻后每孔上樣 30 μg蛋白，行 12%SDSPAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔源性一抗 Beclin-1（1:1000）、LC-3（1︰1000）和β-actin（1︰1000）4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni矯正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠假體周圍骨細胞損傷情況比較

與正常組比較，TCP組小鼠假體周圍骨細胞活性顯著下降，空骨陷窩數(shù)量明顯增加（P＜0.05，圖1），血清中骨細胞特征蛋白DMP-1水平降低，SOST水平上升，造成DMP-1/SOST顯著減少，僅為正常組的39.20%（P＜0.05，圖2）。與TCP組比較，NAC組假體周圍空骨陷窩數(shù)量及DMP-1/SOST明顯增加（P＜0.05，圖1、圖2）。

圖1 HE染色觀小鼠假體周圍骨細胞活性（n=6）

圖2 ELISA法檢測小鼠血清中SOST和DMP-1水平（n=12）

2.2 各組小鼠假體周圍骨細胞凋亡情況

與正常組比較，TCP組假體周圍骨細胞凋亡明顯，其凋亡率高達28.02%，為正常組的7.22倍（P＜0.05，圖3）。與TCP組比較，NAC組假體周圍骨細胞凋亡顯著減少，僅為TCP組的32.05%（P＜0.05，圖3）。

圖3 TUNEL染色流式細胞術(shù)定量分析小鼠假體周圍骨細胞凋亡（n=6）

2.3 各組小鼠假體周圍骨細胞發(fā)生氧化應激情況比較

與正常組比較，TCP組小鼠假體周圍骨細胞發(fā)生氧化應激，表現(xiàn)為骨細胞中MDA和ROS含量明顯增加，SOD活性顯著降低，分別為正常組的的3.10倍、5.25倍和53.57%（P＜0.05，圖4、圖5）。與TCP組比較，NAC組假體周圍骨細胞中MDA和ROS含量顯著降低，SOD活性明顯增加。

圖4 化學比色法檢測小鼠假體周圍骨細胞中MDA含量和SOD 活性（n=6）

圖5 DCFH-DA染色流式細胞術(shù)檢測假體周圍骨細胞內(nèi)ROS水平（n=6）

2.4 各組小鼠假體周圍骨細胞自噬的活化比較

與正常組比較，TCP組假體周圍骨細胞發(fā)生自噬，表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC-3蛋白表達均明顯上調(diào)，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換顯著增加，造成LC-3II/LC-3I上升（P＜0.05，圖6）。與TCP組比較，NAC組假體周圍骨細胞中Beclin-1和LC-3表達顯著降低，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換也明顯減少，LC-3II/LC-3I下降（P＜0.05，圖6）。

圖6 Western blot法檢測小鼠假體周圍骨細胞自噬的活化（n=6）

3 討論

骨細胞的數(shù)量、活性及其功能對骨重建起著重要的作用[2，11]，而骨細胞凋亡常常伴隨著骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎等骨吸收疾病的發(fā)生，同時造成骨脆性增加及骨修復能力減弱[10，11]。Emerton等[12]研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可誘導大鼠股骨和肱骨中骨細胞凋亡，增加局部骨吸收及骨脆性。2016年Cabahug-Zuckerman研究小組報道后肢卸載的小鼠股骨皮質(zhì)骨和骨小梁中骨細胞發(fā)生凋亡，骨吸收顯著；應用Caspase抑制劑QVD能顯著抑制上述骨細胞凋亡和骨吸收[13]。本研究結(jié)果顯示TCP磨損顆?？烧T導假體周圍骨細胞損傷，表現(xiàn)為TCP組假體周圍骨細胞死亡、功能損傷和骨細胞凋亡顯著（圖2、圖3），與TCP磨損顆粒所造成的假體周圍骨溶解趨勢一致[2，6]。提示：骨細胞凋亡參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導的假體周圍破骨細胞活化和骨溶解。

另有研究證實骨細胞自噬也調(diào)控骨吸收。近年有研究顯示糖皮質(zhì)激素誘導的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型中骨細胞發(fā)生自噬[14]；2014年Yang等[15]也報道去卵巢大鼠脛骨近端的骨細胞自噬水平顯著增加，且自噬的活化程度與骨吸收呈正相關(guān)。2016年Wang研究發(fā)現(xiàn)TiAl6V4顆粒能誘導骨細胞MLO-Y4自噬，而干擾自噬相關(guān)基因Atg5可顯著抑制破骨細胞生成[6]。與之類似，本實驗結(jié)果也表明TCP磨損顆?？烧T導假體周圍骨細胞發(fā)生自噬，自噬標志蛋白Beclin-1和LC-3表達顯著增加，LC-3I向LC-3II轉(zhuǎn)換明顯（圖4）。以上研究結(jié)果表明：自噬和凋亡均參與了TCP磨損顆粒誘導的假體周圍骨細胞損傷。

大量研究顯示氧化應激參與調(diào)控細胞凋亡和自噬[7，8]。氧化應激是指機體自由基、ROS產(chǎn)生過多或機體抗氧化能力減弱，ROS清除不足，體內(nèi)ROS蓄積超出了機體的清除能力，導致氧化/抗氧化失衡而造成細胞、組織氧化損傷的病理過程。有研究表明松動假體周圍組織中ROS水平較高，大量的ROS攻擊假體周圍組織細胞后引起氧化物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）和MDA等含量增加，改變細胞膜通透性進而誘導氧化應激反應[16-18]。本實驗結(jié)果也顯示TCP磨損顆?？烧T導假體周圍骨細胞發(fā)生氧化應激，表現(xiàn)為TCP組小鼠假體周圍骨細胞內(nèi)MDA和ROS含量明顯增加，抗氧化物質(zhì)SOD活性顯著降低；其氧化應激活化程度類似于地塞米松誘導體外培養(yǎng)骨細胞MLO-Y4產(chǎn)生ROS[19]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)抗氧化劑NAC能明顯減輕TCP磨損顆粒誘導的假體周圍骨細胞凋亡和自噬，與2015年Tak?eno等[20]和Fontani等[21]觀察到的NAC對血清剝奪或血漿同型半胱氨酸誘導骨細胞MLO-Y4凋亡的影響效果基本一致。但是，對于氧化應激介導的骨細胞凋亡和自噬具體機制如何？還需要我們以后進行深入地研究。

4 結(jié)論

氧化應激參與調(diào)控TCP磨損顆粒誘導的假體周圍骨細胞凋亡和自噬，促進骨細胞死亡及假體周圍骨溶解。