李文靜，王杏茹，劉 濤，陳冰星，賴鐘雄，郭容芳*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州 350002)

自從2002年植物的microRNA(miRNA)第一次被報道之后，人們逐漸獲得了大量關(guān)于植物miRNA生物合成、作用機(jī)制以及可能的生物學(xué)功能等方面的信息[1-2]。植物中的miRNA是一類長度約為20～25 nt的單鏈非編碼小分子RNA[3]。2008年，Brodersen等[4]發(fā)現(xiàn)，miRNA除了通過剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使其沉默外，還可以通過抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式使靶基因沉默。

植物miRNA通過RNase Ⅲ家族Dicer-like1結(jié)合雙鏈RNA結(jié)合蛋白、HYPONASIIC LEAVESI蛋白和 SERRATE蛋白，將miRNA雙鏈核苷酸從miRNA初級體(pri-miRNA)轉(zhuǎn)錄本中切除[2]。pri-miRNA包含半自我互補(bǔ)的折疊或莖環(huán)結(jié)構(gòu)，即miRNA的前體(pre-miRNA)，可產(chǎn)生成熟的miRNA[5]。miR172是較早被發(fā)現(xiàn)的miRNA，在植物中非常保守，其作用方式和生物學(xué)功能已經(jīng)研究得較為深入。2010年，Werner等[6]對擬南芥pri-miR172a進(jìn)行了廣泛的結(jié)構(gòu)功能分析，確認(rèn)了遠(yuǎn)端折疊結(jié)構(gòu)對miR172a加工的重要性。

miR172參與到植物發(fā)育的多種過程中，如開花、塊莖形成、結(jié)瘤和果實發(fā)育等[7]。在模式植物擬南芥中，miR172在轉(zhuǎn)錄和翻譯上抑制其靶基因APETALA2(AP2)作用的發(fā)揮，從而參與到花器官的形態(tài)發(fā)生；miR172還可以通過調(diào)控靶基因TARGETOFEAT1 (TOE1)、TARGETOFEAT2 (TOE2)和TARGETOFEAT3 (TOE3)控制開花時間的早晚。在擬南芥中，共發(fā)現(xiàn)了5個功能冗余的pre-miR172a-e，經(jīng)加工后形成3個成熟的miR172a-c。目前，miR172的同源物已經(jīng)在水稻、大麥、番茄、大豆、馬鈴薯中分離得到。通過比較基因組學(xué)的方法，十字花科植物中的miR172也從其基因組序列中進(jìn)行了預(yù)測，2014年，Shivaraj等[8]的研究表明，在甘藍(lán)中，共有4種miR172，其中包括1個miR172a、3個miR172b、2個miR172d和2個miR172e。本研究篩選分析芥藍(lán)miRNA數(shù)據(jù)庫(SRP076430、SRS1497183和SRX1837757)[9]，獲得了20條miR172成熟體及其前體序列，通過與其他物種中的miR172序列進(jìn)行比對并分析其進(jìn)化特性、結(jié)構(gòu)特征，預(yù)測其靶基因，最后檢測了芥藍(lán)不同發(fā)育時期各部位器官中miR172的表達(dá)水平，初步闡明了miR172在芥藍(lán)發(fā)育過程中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究其功能特征提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本試驗于2015年12月至2016年10月于福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所進(jìn)行，供試材料為‘福州黃花’芥藍(lán)(Brassicaalboglabra)，在2.8 m×1.1 m的畦中種植‘福州黃花’芥藍(lán)，共6畦，每畦種植15株，選取生長勢相似的植株進(jìn)行取樣標(biāo)記，根據(jù)生長期的差異，分別對芥藍(lán)營養(yǎng)生長期(根、莖、葉)和生殖生長期(根、莖、葉、成花、3.5 cm種莢及其中的種子)9個不同組織器官進(jìn)行采樣，采用RNAiso plus(SO1410)法提取總RNA，用TaKaRa SYBR ExScriptTM試劑盒(PK0498)反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行實時熒光定量PCR，每個組織部位3次重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1植物miR172序列的獲取與分析芥藍(lán)miR172家族前體序列及其成熟體序列均來自于芥藍(lán)數(shù)據(jù)庫，耬斗菜(Aquilegiacaerulea)、山羊草(Aegilopstauschii)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)等30種植物的前體與成熟體序列均下載于miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/index.shtml)。miR172a家族前體與成熟體序列分析均采用DNAMAN ver.6.0軟件進(jìn)行，二級結(jié)構(gòu)采用mfold(21)在線軟件(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)進(jìn)行預(yù)測，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹采用MEGA6.0軟件進(jìn)行構(gòu)建。

1.2.2芥藍(lán)miR172a靶基因預(yù)測miRNA通過其靶基因發(fā)揮生物學(xué)功能，本實驗采用多個軟件進(jìn)行miR172靶基因的預(yù)測。首先通過在線軟件(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/?function=3)預(yù)測芥藍(lán)miR172a的靶基因，運行參數(shù)均為默認(rèn)值。然后結(jié)合相應(yīng)的過濾條件如自由能、得分值等進(jìn)行過濾。

1.2.3pre-miR172a家族成員在芥藍(lán)不同發(fā)育階段組織中的表達(dá)分析檢測芥藍(lán)pre-miR172a家族成員在不同組織器官中的表達(dá)情況是進(jìn)一步對芥藍(lán)miR172a進(jìn)行潛在功能分析的重要手段。本試驗利用SYBR qPCR技術(shù)，首先利用DNAMAN ver.6.0對芥藍(lán)pre-miR172不同成員的序列進(jìn)行qPCR引物設(shè)計(表1)，隨后對上述取樣9個組織部位反轉(zhuǎn)錄的材料進(jìn)行實時熒光定量檢測，3次重復(fù)，以Acting為內(nèi)參基因，采用Graphpad軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖表制作，用SPSS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍(lán)miR172a家族成熟體序列分析

為進(jìn)一步了解miR172的功能，本實驗分析了芥藍(lán)中miR172的成熟體。首先從芥藍(lán)miRNA數(shù)據(jù)庫中篩選獲取了20條miR172成熟體序列，它們的序列長度為19～21 nt。利用 DNAMAN ver.6.0軟件對上述20條序列進(jìn)行比對(圖1)，發(fā)現(xiàn)20條序列都存在一個重疊區(qū)域，該區(qū)域中ACTAGATC 8個堿基高度保守，并且在芥藍(lán)pre-miR172的3′和5′端均能形成成熟體。

2.2 芥藍(lán)pre-miR172a家族二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

植物體內(nèi)的活性分子均以一定形態(tài)出現(xiàn)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可能影響其功能的強(qiáng)弱，因此對芥藍(lán)pre-miR172a家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測顯得非常重要。本試驗采用3.5版mfold在線軟件對5條芥藍(lán)pre-miR172a序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(圖2)，結(jié)果顯示，所有序列折疊后均能形成典型、復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其序列的最小折疊自由能在-54.55～-78.60 kal/mol之間，可見pre-miR172a在芥藍(lán)體內(nèi)均能自發(fā)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。通過其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，芥藍(lán)pre-miR172a的最小折疊自由能在一定程度上與序列的堿基數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即堿基數(shù)越多，最小折疊自由能的負(fù)值越大，但它同樣也可能受其他因素的影響，如序列G/A比值、莖環(huán)數(shù)目及莖環(huán)大小等。

2.3 植物pre-miR172a家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹是對植物miR172a家族進(jìn)行進(jìn)化特征分析的重要手段。試驗從miRBase數(shù)據(jù)庫中篩選獲得耬斗菜、山羊草、擬南芥等30個pre-miR172a成員，利用MEGA6.0軟件對5個芥藍(lán)pre-miR172a與上述30個序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)。由圖3可知，整個進(jìn)化樹分為2大分支，bal-pre-miR172a-5p-2、cme-pre-miR172a、cpa-pre-miR172a、bal-pre-miR172a-1、bal-pre-miR172a-2和bal-pre-miR172a-3為其中一支，其余成員共為另一支。分析發(fā)現(xiàn)芥藍(lán)miR172a成員總體分布比較集中，除bal-pre-miR172a-4外，其他4個成員：bal-pre-miR172a-5p-2、bal-pre-miR172a-1、bal-pre-miR172a-2和bal-pre-miR172a-3為一支，可見芥藍(lán)pre-miR172a家族在進(jìn)化過程中也相對保守，但從總體上分析芥藍(lán)與番木瓜的pre-miR172a親緣關(guān)系較近。

圖1 芥藍(lán)miR172序列比對分析Fig.1 Analysis of pre-miR172a sequences in B. alboglabra

2.4 植物miR172a家族成熟體系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建與序列分析

為進(jìn)一步了解植物miR172a家族的分布與序列進(jìn)化特性，試驗從miRBase數(shù)據(jù)庫中篩選獲取30種植物，從芥藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出5條miR172a成熟體，發(fā)現(xiàn)所有成員的堿基數(shù)非常穩(wěn)定，均在20～21nt間。利用MEGA6.0和DNAMAN ver.6.0軟件對芥藍(lán)、耬斗菜、山羊草等41條成熟體序列進(jìn)行比對與進(jìn)化樹構(gòu)建(圖4)，發(fā)現(xiàn)植物miR172a的41個成員被分成兩支，csi-miR172a-5p、ppe-miR172a-5p、stu-miR172a-5p、aly-miR172a-5p、bal-miR172a-5p-2、ata-miR172a-5p、bdi-miR172a-5p和gra-miR172a為一支，其它29個成員為另一支，可見csi-miR172a-5p、ppe-miR172a-5p、stu-miR172a-5p、aly-miR172a-5p、bal-miR172a-5p-2、ata-miR172a-5p、bdi-miR172a-5p和gra-miR172a與其他成員的親緣性較遠(yuǎn)，序列比對也充分驗證了該觀點。通過對大分支進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有20個堿基高度重疊，再次驗證了植物miR172a在進(jìn)化過程中具有高度的保守性，這也暗示了植物miR172a家族成員間功能的相似性與協(xié)同性。

2.5 芥藍(lán)miR172a家族靶基因預(yù)測分析

對芥藍(lán)miR172a家族成員進(jìn)行靶基因預(yù)測是對其生物學(xué)功能分析的間接手段。本試驗采用psRNATarget在線軟件對miR172a家族成員進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，5個miR172a家族成員共存在13個靶標(biāo)基因。表2也發(fā)現(xiàn)miR172a-1、miR172a-2、miR172a-3和miR172a-4這4個成員均可作用于相同靶標(biāo)——AP2家族基因，再次驗證了芥藍(lán)miR172a家族在進(jìn)化過程中功能上確實具有保守性和協(xié)同性。

圖2 芥藍(lán)pre-miR172a家族二級莖環(huán)結(jié)構(gòu)A. pre-miR172a-1；B.pre-miR172a-2；C.pre-miR172a-3；D.pre-miR172a-4；E.pre-miR172a-5p-2Fig.2 Analysis of pre-miR172a structure in B. alboglabra

ath.擬南芥；aly.深山南芥；sbi.高粱；osa.稻；ata.山羊草；bdi.二穗短柄草；bna.歐洲油菜；bra.蕪菁；bol.甘藍(lán)；vvi.葡萄; aqc. 耬斗菜；mes.木薯；gra.雷蒙德氏棉；mdm.蘋果；nta.煙草；tcc.可可；mtr.蒺藜狀苜蓿；lja.百脈根；csi.甜橙；zma.玉米; lus.亞麻；ppe.碧桃；ptc.毛果楊；gma.大豆；dpr.毛地黃；sly.番茄；stu.馬鈴薯；egu.油棕；bal.芥藍(lán)；cme.香瓜；cpa.番木瓜；圖4同圖3 利用NJ法構(gòu)建植物pre-miR172a進(jìn)化樹ath. Arabidopsis thaliana；aly.Arabidopsis lyrata；sbi.Sorghum bicolor；osa.Oryza sativa；ata.Aegilops tauschii；bdi.Brachypodium distachyon；bna.Brassica napus；bra.Brassica rapa；bol.Brassica oleracea；vvi.Vitis vinifera; aqc. Aquilegia caerulea；mes.Manihot esculenta；gra.Gossypium raimondii；mdm.Malus domestica；nta.Nicotiana tabacum；tcc.Theobroma cacao；mtr.Medicago truncatula；lja.Lotus japonicus；csi.Citrus sinensis；zma.Zea mays; lus：Linum usitatissimum；ppe.Prunus persica；ptc.Populus trichocarpa；gma.Glycine max；dpr.Digitalis purpurea；sly.Solanum lycopersicum；stu.Solanum tuberosum；egu.Elaeis guineensis；bal.Brassica alboglabra；cme.Cucumis melo；cpa.Carica papaya; The same as Fig.4Fig.3 Phylogenetic relationships among pre-miR172a sequences using NJ method

圖4 miR172a家族成熟體序列分析Fig.4 Analysis of mature miR172a sequences

2.6 pre-miR172家族不同成員在芥藍(lán)不同組織部位中的表達(dá)分析

通過實時熒光定量PCR，對芥藍(lán)5個pre-miR172a成員和5個pre-miR172b成員在9個組織部位中的轉(zhuǎn)錄水平分別檢測(圖5、6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10個成員在9個組織部位中的表達(dá)各不相同。pre-miR172a的5個成員中pre-miR172a-2和pre-miR172a-3表達(dá)比較高，pre-miR172a-4和pre-miR172a-5p-2表達(dá)比較低，pre-miR172a-1表達(dá)居中。pre-miR172a-2和pre-miR172a-3在生殖生長階段主要在莢和種子里表達(dá)；pre-miR172a-1在營養(yǎng)生長階段主要在葉中表達(dá)，在生殖生長階段則主要在莢和種子里表達(dá)； pre-miR172a-4在營養(yǎng)生長階段主要在根中表達(dá)；而pre-miR172a-5p-2在9個部位均有表達(dá)。pre-miR172b 5個成員中pre-miR172b-5p和pre-miR172b-5p-4表達(dá)比較高，pre-miR172b、pre-miR172b-5p-2和pre-miR172b-5p-3表達(dá)次之。pre-miR172b-5p、pre-miR172b-5p-2、pre-miR172b-5p-3和pre-miR172b-5p-4在營養(yǎng)生長階段主要在葉中表達(dá)，在生殖生長階段主要在花、莢和種子里表達(dá)，并且表達(dá)量都是花中最高；pre-miR172b在生殖生長階段則主要在莢、花和種子中表達(dá)。由此看出芥藍(lán)從營養(yǎng)生長階段到生殖生長階段miR172b的表達(dá)有從葉片到花的一個很明顯的轉(zhuǎn)移。

A～C.營養(yǎng)生長階段的根、莖、葉；D～I(xiàn). 生殖生長階段的根、莖、葉、花、莢和種子圖5 芥藍(lán)營養(yǎng)生長期和生殖生長期的器官A-C. Root, stem and leaf in the stage of vegetative growth; D-I. Root, stem, leaf, flower, pod and seed in the stage of reproductive growthFig.5 Different tissues of B. alboglabra

3 討 論

3.1 植物miR172家族進(jìn)化特性

miR172是一類保守的miRNA，在植物中廣泛存在。雖然miR172家族成員的長度和數(shù)目在不同的植物中各不相同，但在進(jìn)化上保守性極強(qiáng)，近緣物種中序列幾乎一致，說明miR172的功能和作用方式在不同物種中可能也具有潛在的保守性。芥藍(lán)中，miR172有6個成員，分別是bal-miR172a、bal-miR172b、bal-miR172c、bal-miR172d、bal-miR172e和bal-miR172j。其中miR172a又有5個成員：bal-miR172a-1、bal-miR172a-2、bal-miR172a-3、bal-miR172a-4和bal-miR172a-5p-2；miR172b也有5個成員：bal-miR172b、bal-miR172b-5p 、bal-miR172b-5p-2、bal-miR172b-5p-3和bal-miR172b-5p-4。

miR172不同成員的啟動子結(jié)構(gòu)和順式調(diào)控元件組成并不相同，故而其表達(dá)具有時空特異性，說明這些成員在植物發(fā)育的不同階段發(fā)揮著各不相同或者協(xié)同調(diào)控的作用[10]。對于miR172不同成員的研究，在擬南芥、水稻、大豆和月季中均有報道。擬南芥中miR172共有5個成員，包括2個miR172a、2個miR172b和1個miR172c。擬南芥生長過程中miR172a-1、miR172a-2和 miR172b-1的表達(dá)量逐漸增加，miR172b-2 和miR172c的表達(dá)水平則非常低，未表現(xiàn)出與植物營養(yǎng)生長和生殖生長發(fā)育轉(zhuǎn)換的相關(guān)性[11]。在水稻中，miR172共有4個成員，miR172a、miR172b、miR172c和miR172d。水稻中4個miR172成員的表達(dá)量在幼苗期均上升，在谷粒中miR172a、miR172b和miR172d均有表達(dá)，但miR172c則未檢測到[12]。在大豆中，共發(fā)現(xiàn)12個miR172成員，其中miR172a、miR172b、miR172c、miR172d和miR172e前體的表達(dá)水平較高，且主要在大豆的真葉中表達(dá)[13]。月季中共有12個miR172成員，其中miR172a在花柱中大量表達(dá)，且隨著日照變化呈現(xiàn)規(guī)律性的波動，而miR172c表達(dá)很少[14]。

圖中柱形圖上不同小寫字母表示組織間差異顯著(P<0.05)。RG-Root.生殖生長階段的根；RG-Stem.生殖生長階段的莖；RG-Leaf.生殖生長階段的葉；RG-Flower.生殖生長階段的花；RG-Pod.生殖生長階段的3.5 cm長的除去種子的莢；RG-Seed.生殖生長階段的3.5 cm長的莢對應(yīng)的種子；VG-Root.營養(yǎng)生長階段的根；VG-Stem.營養(yǎng)生長階段的莖；VG-Leaf.營養(yǎng)生長階段的葉圖6 pre-miR172a和pre-miR172b家族在芥藍(lán)不同組織部位中的表達(dá)分析The different lowercase letters on the graph indicate significant difference among tissues and stages at 0.05 level(P<0.05).RG-Root. Root of the reproductive growth; RG-Stem. Stem of the reproductive growth; RG-Leaf. Leaf of the reproductive growth; RG-Flower. Flower of the reproductive growth; RG-Pod. Pod of the reproductive growth; RG-Seed. Seed of the reproductive growth; VG-Root. Root of the vegetative growth; VG-Stem. Stem of the vegetative growth; VG-Leaf. Leaf of the vegetative growthFig.6 Expression pattern of pre-miR172a and pre-miR172b family in different developmental stages and tissues of B. alboglabra

3.2 芥藍(lán)中miR172的表達(dá)模式及其潛在功能

芥藍(lán)中miR172a和miR172b的表達(dá)模式不同，miR172a主要在生殖生長期的莢和種子中表達(dá)，miR172b則主要在花中表達(dá)，說明miR172a和miR172b在功能上有分工。miR172可以與植物花型同源基因AP2的信使RNA進(jìn)行堿基配對，在翻譯水平上調(diào)控其表達(dá)。miR172通過調(diào)控靶基因AP2促進(jìn)植物由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換的功能在很多物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，研究認(rèn)為這種促進(jìn)作用在高等植物中廣泛存在。大豆中g(shù)ma-miR172a有一種晝夜節(jié)律表達(dá)的模式，隨著植物的生長，直到大豆開花，它的豐度急速增加。gma-miR172a的過表達(dá)植株中成花素的含量增加，出現(xiàn)了早花表型，抗gma-miR172a的Glyma03g33470基因的過度表達(dá)削弱了早期開花顯型的表現(xiàn)[15]。在水稻中，miR172通過調(diào)控屬于AP2家族的OsTOEl和SNB(SUPERNUMERARYBRACT)進(jìn)而參與水稻的生殖生長過程[10]。芥藍(lán)的pre-miR172b-5p和pre-miR172b-5p-2在花中的大量表達(dá)說明其在芥藍(lán)花的發(fā)育中起著重要作用。

除了對開花的促進(jìn)作用，近年來miR172調(diào)控果實發(fā)育的功能在高等植物中也有報道，miR172對果實發(fā)育的調(diào)控依賴于物種果實的類型。在擬南芥中，miR172的過表達(dá)可以促進(jìn)擬南芥花莢的生長，擬南芥的莢果來源于心皮組織，受到AP2的負(fù)調(diào)控，增加miR172的表達(dá)水平會減少靶基因AP2的含量，進(jìn)而減輕對種莢生長的抑制作用[4]。在蘋果中，過表達(dá)miR172卻使得蘋果的果實變小。蘋果的果實是梨果，由萼片、花瓣和雄蕊等組成的萼筒發(fā)育而來，其中萼片主要發(fā)育為果實。由于AP2正調(diào)控萼片的發(fā)育，過表達(dá)蘋果的miR172會減少其AP2的積累，影響萼片發(fā)育，最終導(dǎo)致果實變小[5]。番茄的漿果是由子房發(fā)育而來的，過表達(dá)miR172則會使得番茄出現(xiàn)只剩心皮的花，最終發(fā)育成為單性果實[11]。