高玉龍，王丙武，李文正，李梅云，宋中邦，吳玉萍

(云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點實驗室，國家煙草基因工程研究中心，昆明650021)

鎘是常見的土壤重金屬污染物之一。種植于鎘污染土壤上的植物能夠從土壤中吸收鎘，進而對植物和人體造成傷害。近年來，隨著工業(yè)快速發(fā)展，礦產(chǎn)資源的不合理開采等原因，鎘污染問題日益嚴重[1]。2014年中國土壤污染狀況調(diào)查公報披露，中國土壤污染物總的超標率為16.1%，污染類型以無機型為主，其中又以鎘污染為主要污染類型，其點位超標率為7%，從污染分布情況來看，南方土壤污染較重，西南、中南地區(qū)土壤重金屬超標范圍較大[2]。當(dāng)鎘含量為植物葉片干重的5～10 mg/kg時，就會對植物造成傷害[3]。鎘是植物生長發(fā)育的非必需元素。植物中，鎘的流向主要有3個：根部吸收、根部螯合及向地上部運輸。

目前，對鎘從根部向地上部的運輸機制研究得較為清楚。鎘的轉(zhuǎn)運體主要包括AtIRT1(iron-regulated transporter 1)、AtNRAMP3(natural resistance-associated macrophage)[4]、AtHMA2[5]和AtHMA4[6]等。擬南芥中AtHMA2、AtHMA4基因的研究結(jié)果表明：過量表達AtHMA4基因可提高植株對鎘的耐性及吸收力[7-8]，而HMA4基因突變后則能增強植物對鎘的敏感性[9]。水稻OsHMA2蛋白是水稻鋅和鎘從根向莖的主要轉(zhuǎn)運體[10]。在擬南芥中過量表達大麥HvHMA2基因可部分恢復(fù)擬南芥雙突變體hma2hma4鋅和鎘的轉(zhuǎn)運能力[11]?？梢姴煌参镏械腍MA蛋白功能上具有保守性。

煙草(NicotianatabacumL.)是鎘富集植物，且主要積累于葉片。中國各煙區(qū)煙葉中的鎘含量平均為2.95 mg/kg，最高為19.35 mg/kg[12]。與其他重金屬相比，鎘在煙氣中的遷移率較高。吸煙成為人體攝入鎘的重要途徑之一，因此降低煙葉中鎘含量成為煙草生產(chǎn)及育種工作的重要目標[13]。該研究以功能研究較為清楚的植物鎘轉(zhuǎn)運基因HMA4為靶標，利用TILLING技術(shù)篩選‘云煙87’ EMS突變體庫，獲得一個該基因的錯義突變體。對該突變體進行鎘脅迫試驗，以期獲得對鎘轉(zhuǎn)移能力下降的煙草材料，為培育低鎘含量煙草品種提供育種材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘云煙87’野生型種植于云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地，開花期取根、莖(距根部1/3處)、葉(第10位葉)、花組織液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩? 842份‘云煙87 ’EMS突變體由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院創(chuàng)制并保存。利用TILLING技術(shù)從該突變體庫中篩選獲得NtHMA4基因發(fā)生核苷酸改變的一個突變體hma4-4h12，該突變體用于鎘脅迫試驗及大田農(nóng)藝性狀調(diào)查。

1.2 方 法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成按照試劑盒RNAiso Plus(Takara，日本)的操作說明，提取野生型‘云煙87’開花期根、莖、葉、花的總RNA。由微量紫外檢測儀Nano-Drop檢測RNA濃度。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，日本)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2NtHMA4基因組織特異性表達分析根據(jù)基因NtHMA4 CDS序列(NCBI登錄號HF937054.1)設(shè)計qRT-PCR引物HMA4QF(GTTTCAGAATCAAAGTCATGTG)和HMA4QR(GCAGATTGGC-ATGCTTTAGA)。以煙草Actin基因作為內(nèi)參，設(shè)計PCR引物Actin-F(CTGAGGTCCTTTTCCAACCA)和 Actin-R(TACCCGGGAACATGGTAGAG)。

以cDNA為模板進行熒光定量PCR，反應(yīng)在Roche LightCycler 480上利用LightCycler 480 SYBR Green I master進行，20 μL體系含有 10 μL LightCycler 480 SYBR Green I master(2×)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，cDNA 1 μL(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋4倍)，7 μL 滅菌蒸餾水。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃退火 20 s，61 ℃變性 15 s，72 ℃延伸15 s，45個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對擴增產(chǎn)物熒光值變化和溶解曲線進行分析。相對表達量使用2-ΔΔCt方法，3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3TILLING篩選NtHMA4基因突變體利用Primer 3設(shè)計TILLING引物，T-HMA4-F(TAG-AGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAG)和T-HMA4-R(ATAAGCTGAGAGCTTAAGAAAAAA-GAAACT)。利用DNeasy Plant Mini Kit提取突變體庫中1 842份M2代材料葉片的DNA。將所有樣品的DNA濃度稀釋至40 ng/μL，組建成8倍樣品池用于TILLING檢測。TILLING檢測步驟具體參照文獻[14]。篩選的突變體M3代通過測序進行驗證，最終獲得純合突變體hma4-4h12。

1.2.4突變體鎘脅迫試驗將突變體hma4-4h12及對照‘云煙87’種植于溫室，晝/夜溫度為(25±1)℃/(20±1)℃。盆栽試驗使用28 cm×28 cm塑料盆，盆栽介質(zhì)為煙草育苗基質(zhì)∶沙=1∶1。每株施煙草專用肥(N∶P∶K=1∶1.5∶2.8)30 g，分5次施入，突變體和對照種植各20株，各取9株長勢一致的煙苗進行試驗?，F(xiàn)蕾期[15]將500 mL CdCl2溶液(100 μmol/L)澆于煙株根部，5 d后取第17～19片葉[16-17]，去梗后100 ℃殺青，60 ℃烘干備用。

1.2.5重金屬含量的檢測根據(jù)煙草行業(yè)標準YC/T380-2010[18]，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定煙葉中鎘、砷、鉛、鉻、鎳的含量。樣品粉碎后過100目篩，稱取0.2～0.3 g樣品于消解罐中，樣品精確到0.1 mg。向消解罐中依次加入5 mL 65%濃硝酸和2 mL 30%過氧化氫，旋緊消解罐蓋子，置于微波消解儀中。消解程序：室溫經(jīng)5 min升至100 ℃，保持5 min；再經(jīng)5 min升至130 ℃，保持5 min；最后經(jīng)10 min升至190 ℃，保持20 min。消解完畢后，待溫度降至室溫后取出消解罐。將消解罐中的樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL塑料容量瓶中，用去離子水沖洗消解罐3～4次，將清洗液一并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用去離子水定容，搖勻后將所得的樣品溶液進行檢測。鋅、銅、鐵、錳的檢測前處理同上，不同的是消解后的樣品上電感耦合等離子體光譜儀進行檢測。

1.2.6大田農(nóng)藝性狀調(diào)查試驗在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院玉溪市研和試驗基地進行，種植密度為120 cm×50 cm。使用煙草專用肥，N∶P∶K=1∶1.5∶2.8，施肥量按75 kg/hm2進行，底肥占總施肥量的30%，追肥分5次施入，占70%。在中心花開放時打頂。農(nóng)藝性狀參照中國煙草行業(yè)標準YC/T 142-2010[19]進行調(diào)查。采用完全隨機區(qū)組設(shè)計進行試驗，突變體hma4-4h12和對照‘云煙87’分別設(shè)5個小區(qū)，每個小區(qū)種植50株。在每個小區(qū)中選擇5株具有代表性的煙株進行農(nóng)藝性狀調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtHMA4基因組織特異性表達分析

擬南芥、水稻等作物[20-21]中HMA4基因主要在根中表達。對煙草不同組織中NtHMA4基因的表達研究結(jié)果(圖1)顯示，該基因在煙草根中表達量最高，莖和花中微量表達，葉中基本不表達。該基因的表達模式與其編碼蛋白功能有關(guān)，重金屬Cd或Zn等在根部與HMA4蛋白結(jié)合并運往地上部。

2.2 NtHMA4基因突變體的獲得

HMA4是植物二價重金屬鎘、鋅從地下部向地上部轉(zhuǎn)運的主要轉(zhuǎn)運體。煙草NtHMA4基因ORF長4 335 bp，編碼1 444個氨基酸。利用TILLING技術(shù)從1 842份‘云煙87’ EMS突變體庫中獲得1個NtHMA4基因錯義突變體，其核苷酸突變方式為C152T，氨基酸突變方式為T51I，命名為hma-4h12。突變體突變位點在NtHMA4基因組中的示意圖見圖2。該突變體突變位點位于NtHMA4基因5′端，突變體中第51位氨基酸由極性氨基酸蘇氨酸變?yōu)榉菢O性的異亮氨酸，該突變可能對蛋白的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。通過測序獲得了純合突變株系(圖3)。

圖1 NtHMA4基因組織特異性表達分析Fig.1 Analysis of tissue specific expression of NtHMA4

方框所示為突變位點圖3 hma4-4h12純合突變體測序結(jié)果box is shown as a mutation siteFig.3 Identification of homozygous mutation site by sequencing

圖2 突變體hma4-4h12中NtHMA4基因突變位點示意圖Fig.2 Diagram of mutation site of hma4-4h12 in NtHMA4 gene

2.3 突變體鎘脅迫試驗

溫室種植突變位點純合的突變體hma4-4h12。現(xiàn)蕾期在煙株根部施入500 mL 100 μmol/L CdCl2，處理后5 d取中部葉片殺青、烘干后檢測重金屬含量。與對照相比(圖4)，突變體hma4-4h12葉片中的鎘、鋅、砷含量分別降低55.48%、21.11%、27.50%，差異均達到極顯著水平；銅、鉛、鎳含量分別降低20.96%、16.23%、19.28%，差異達到顯著水平；突變體鐵、錳和鉻含量與對照沒有顯著差異。這些重金屬中，鎘、鉻、鉛和砷不參與植物的生理過程，而鋅、鐵、錳、銅和鎳或參與植物氧化還原反應(yīng)，或作為酶、其他蛋白的輔酶因子、配位基團。

2.4 突變體農(nóng)藝性狀

由于hma4-4h12是EMS誘變獲得的，除了目標基因突變外，可能還有許多未知位點的突變，這些突變可能會影響到hma4-4h12的表型，為了研究該突變體大田農(nóng)藝性狀是否有明顯的缺陷，在大田種植該突變體對農(nóng)藝性狀進行了觀察比較。結(jié)果表明(圖5)，突變體hma4-4h12自然株高、打頂株高與對照相比變矮，且差異達極顯著水平；莖圍、節(jié)距、最大腰葉長與對照相比變小，且差異達極顯著水平；hma4-4h12自然葉數(shù)與對照相比變少，其差異達顯著水平。可見突變體hma4-4h12與對照相比在農(nóng)藝性狀上具有較大差異。該突變體在生產(chǎn)上進行應(yīng)用還需要對缺陷性狀進行回交改良。

*和**分別表示0.05和0.01水平上差異顯著。下同圖4 突變體重金屬含量*and * indicate significant difference at 0.05 level and 0.01 level，respectively. The same as belowFig.4 Content of heavy metal in mutant tobacco leaf

3 討 論

隨著工業(yè)化進程的加速，重金屬鎘污染日趨嚴重。鎘通過食物最終被人體吸收，可以對人體造成重大傷害。煙草是中國重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位。煙草對鎘的富集作用較大，降低煙草鎘含量是當(dāng)前煙草減害的一個重要目標。HMA4是植物鎘轉(zhuǎn)運的主要蛋白之一，主要負責(zé)鎘從根部向地上部的轉(zhuǎn)運[5-7,10]。擬南芥AtHMA4基因突變后可顯著降低鎘從根部向地上部的轉(zhuǎn)運率[5]。煙草以葉片為收獲對象，通過抑制鎘從根部向地上部的轉(zhuǎn)運而獲得煙葉鎘含量降低的煙草品種是一個有效的途徑。

本研究獲得了一個煙草鎘轉(zhuǎn)運基因NtHMA4的EMS突變體hma4-4h12，該突變體第51位氨基酸由極性氨基酸蘇氨酸變?yōu)榉菢O性的異亮氨酸。通過鎘脅迫試驗發(fā)現(xiàn)，突變體hma4-4h12葉片中的鎘含量比對照降低55.48%。另外，鋅、銅、砷、鉛、鎳也降低明顯。而鐵、錳和鉻含量與對照沒有顯著差異。重金屬中，鎘、鉻、鉛和砷不參與植物的生理過程，而鋅、鐵、錳、銅和鎳或參與植物氧化還原反應(yīng)，或作為酶、其他蛋白的輔酶因子、配位基團。如，鐵參與葉綠體和線粒體中的電子傳遞過程、抗氧化脅迫、氮的固定、激素合成等過程。錳是SOD、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等的輔酶因子[22]；鋅做為輔酶因子在電子傳遞和抗氧化代謝中起重要作用，也是許多轉(zhuǎn)錄因子的組成部分[23]。hma4-4h12突變體同時降低了鎘、鉛、砷等3種植物生長不需要的有害重金屬，在低重金屬含量培育中可以廣泛應(yīng)用。

圖5 突變體大田農(nóng)藝性狀Fig.5 Field agronomic traits of mutant

hma4-4h12是由EMS突變體庫中篩選獲得的，除了目標位點外，可能還有許多突變會影響其表型等。大田種植突變體，對其表型性狀進行了觀察比較。突變體hma4-4h12與對照相比株高、節(jié)距、莖圍等顯著變小。可見hma4-4h12中含有影響這些性狀的突變位點。為了利用hma4-4h12培育低鎘煙草品種，后續(xù)還需要通過回交去除這些不利突變的影響。