江 暉，廖天宇，李廣鵬，袁玲玲，耿文華

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816))

砷及砷化物是聯(lián)合國(guó)環(huán)境署確認(rèn)的對(duì)人體有巨大危害的一類(lèi)物質(zhì)[1]。自然環(huán)境中砷元素分布非常廣泛，其主要形態(tài)為三價(jià)砷(As(Ⅲ))、五價(jià)砷(As(Ⅴ))、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)；海產(chǎn)品中主要為砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)。一般認(rèn)為，As(Ⅲ)的毒性大于As(Ⅴ)，而DMA、MMA的毒性小于無(wú)機(jī)砷，AsB和AsC通常被認(rèn)為毒性較低近似無(wú)毒[2]。砷中毒包括慢性中毒和急性中毒[3]，長(zhǎng)期攝入含微量砷的食品、飲品等會(huì)導(dǎo)致慢性中毒。當(dāng)人體攝入70～200 mg的無(wú)機(jī)砷化合物后會(huì)引發(fā)急性中毒，主要癥狀為休克、心律不齊、身體抽搐，甚至死亡[4]。隨著我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展，大量含砷化合物的畜禽飼料及飼料添加劑(羅沙胂、阿散酸等)被廣泛使用，但動(dòng)植物不能完全吸收，絕大部分的砷元素隨畜禽的排泄物進(jìn)入水體、土壤而在環(huán)境中不斷累積，從而加大了環(huán)境污染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。

由于不同砷形態(tài)具有不同的毒性，而傳統(tǒng)分析方法不能準(zhǔn)確分析各類(lèi)砷形態(tài)及其含量，無(wú)法準(zhǔn)確判斷砷的毒性大小，因此砷形態(tài)分析具有重要的實(shí)際意義。高效液相色譜(HPLC)具有分離效果好、重復(fù)性高等特點(diǎn)，因此常與各類(lèi)檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合[6]用于砷形態(tài)的測(cè)定。而原子熒光(AFS)可測(cè)定各類(lèi)無(wú)機(jī)砷與有機(jī)砷，具有選擇性好、檢出限低、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)。電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)具有可同時(shí)測(cè)定多種元素、靈敏度較高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在測(cè)定總砷及各類(lèi)重金屬含量方面得到了較廣泛的應(yīng)用。

目前，對(duì)于痕量和超痕量檢測(cè)的要求越來(lái)越高，樣品預(yù)處理方法的研究成為重要的研究方向。砷形態(tài)的完全提取，以及避免基體樣品污染、砷物質(zhì)的揮發(fā)和吸附，已成為當(dāng)前預(yù)處理方法研究的重要方向。按照所用的試劑不同，砷的萃取方法可分為酶萃取[7]、水萃取[8]、甲醇-水萃取[9]、氯仿-甲醇-水萃取、磷酸萃取[10]等。Giral等[11]利用磷酸提取土壤中的砷形態(tài)，發(fā)現(xiàn)磷酸是一種高效、溫和的萃取劑。本文以磷酸作為萃取試劑，利用微波萃取技術(shù)萃取污泥中的砷形態(tài)，采用LC-AFS測(cè)定污泥中的砷形態(tài)及其含量，同時(shí)采用ICP-OES測(cè)定污泥中總砷含量，并對(duì)各實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)建立快速、高效測(cè)定污泥中砷形態(tài)的檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Min plus純水儀(德國(guó)Sartorius公司)，PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁公司)，H1850離心機(jī)(湘儀公司)，GZX-9140 MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，BSA 124S電子天平(Sartorius AG)，MDS-6溫壓雙控微波消解/萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)，ICAP 6300電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(Thermo-Fisher Scientific Inc.)，LC-AFS 9600液相色譜原子熒光聯(lián)用儀(北京海光儀器公司)。

甲醇(色譜純，永華化學(xué)有限公司)，鹽酸(優(yōu)級(jí)純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，硝酸(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(分析純，西隴化工股份有限公司)；過(guò)氧化氫、硼氫化鉀(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；砷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 mg/L，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)量中心)；As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)液、As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)液(1 000 mg/L，北京神州科創(chuàng)生物科技有限公司)；MMA標(biāo)準(zhǔn)液(25 mg/L)、DMA標(biāo)準(zhǔn)液(50 mg/L)、AsB標(biāo)準(zhǔn)液(40 mg/L)均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 樣品采集、保存與預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)污泥取自江蘇省某大型養(yǎng)殖基地沼氣池，含水量約為85%，新鮮的污泥樣品在現(xiàn)場(chǎng)取樣后，用塑料容器密封，置于存有冰袋的保溫盒中，運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后于4 ℃冰箱中保存。

實(shí)驗(yàn)前將新鮮的污泥樣品放在恒重的稱(chēng)量瓶中，置于25 ℃烘箱中24 h后，升溫至65 ℃下恒重(兩次質(zhì)量差小于1 mg)后得到干污泥，備用。

1.3 色譜條件與儀器參數(shù)

結(jié)合文獻(xiàn)[12]，液相色譜(LC)條件設(shè)置為：Hamilton PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)；載流為5%(體積分?jǐn)?shù))HCl;流動(dòng)相為15 mmol/L (NH4)2HPO4溶液；還原劑為5 g/L NaOH和10 g/L KBH4；進(jìn)樣體積100 μL；流速1.0 mL/min。

LC-AFS配備紫外氧化系統(tǒng)，砷形態(tài)的分離使用Hamilton色譜柱(250 mm×4.1 mm)。在紫外氧化系統(tǒng)中(紫外燈功率為24 W，流路長(zhǎng)度為30 cm，內(nèi)徑為0.8 mm)，使用流速為0.36 mL/min的20 g/L K2S2O8溶液進(jìn)行砷化物的光氧化，其后與還原劑(5 g/L NaOH和10 g/L NaBH4)和載流(5%HCl)反應(yīng)產(chǎn)生揮發(fā)性的砷氫化物后，采用AFS進(jìn)行檢測(cè)[13-14]。

ICP-OES條件：還原劑為4 g/L NaOH和10 g/L KBH4的混合溶液；樣品提升速率為1.0 mL/min。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedure

圖1 不同萃取劑對(duì)砷形態(tài)萃取回收率的影響Fig.1 Influences of different extraction reagents on extraction recoveries of arsenic species

圖2 不同pH值對(duì)砷形態(tài)保留時(shí)間的影響Fig.2 Effects of different pH values on retention time of arsenic forms

1.4 樣品前處理

1.4.1微波消解稱(chēng)取0.2 g干污泥于消解容器中，加入5 mL HNO3和2 mL H2O2的混酸靜置一段時(shí)間，蓋好蓋后進(jìn)行微波消解，相關(guān)程序見(jiàn)表1。消解結(jié)束后靜置冷卻，將溶液完全移出，用10%(體積分?jǐn)?shù))HNO3定容至25 mL，利用ICP-OES測(cè)定T-As含量[15]，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.4.2微波萃取稱(chēng)取0.1 g干污泥于萃取容器中，加入萃取溶液5 mL進(jìn)行微波萃取后，將萃取液以5 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑的選擇

為有效提取污泥中砷形態(tài)，并確保砷形態(tài)在萃取過(guò)程中不被破壞，萃取劑的選擇至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇-水(體積比1∶1)混合溶液和0.25 mol/L H3PO4作為萃取劑，利用微波萃取法萃取。4種砷形態(tài)污泥樣品的加標(biāo)(20 μg/g,以干污泥含量計(jì))回收率如圖1。由圖1可知，H3PO4對(duì)砷形態(tài)的萃取回收率明顯優(yōu)于甲醇-水混合溶液，主要原因在于：砷和磷元素是同族元素,化學(xué)性質(zhì)相近；磷酸鹽與砷酸鹽的化學(xué)形態(tài)較相似，H3PO4作為萃取劑有利于砷的萃取。因此，實(shí)驗(yàn)最終選擇0.25 mol/L H3PO4為萃取劑。

2.2 pH值的優(yōu)化

利用LC-AFS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定砷形態(tài)，需使各砷形態(tài)在液相色譜中得到完全分離，才能進(jìn)一步被原子熒光檢測(cè)。流動(dòng)相的pH值是液相色譜分離砷形態(tài)的主要影響因素。本實(shí)驗(yàn)以(NH4)2HPO4溶液為流動(dòng)相，考察了50 μg/L的As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA標(biāo)準(zhǔn)溶液在流動(dòng)相pH值為5.0～7.5時(shí)的保留時(shí)間(圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pH值對(duì)As(Ⅲ)的保留時(shí)間無(wú)顯著影響，這是因?yàn)锳s(Ⅲ)的pKa1=9.3，pH<9.3時(shí)，As(Ⅲ)主要是三氧化二砷化合物，與試劑反應(yīng)的可能性較小，在色譜柱中幾乎無(wú)保留[16]。當(dāng)pH值為5.0～7.5時(shí)，DMA的保留時(shí)間隨pH值的增大而增加；MMA的保留時(shí)間隨pH值的增大而減??；而As(Ⅴ)的保留時(shí)間隨pH值的增大出現(xiàn)先減小后增大的情況，且在pH 6.0時(shí)的保留時(shí)間最短。綜合考慮選擇最佳流動(dòng)相pH值為6.0。

2.3 甲醇用量的優(yōu)化

在流動(dòng)相中添加甲醇，可以改善締合分子在兩相中的分配，提高檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度；但過(guò)量的甲醇會(huì)增加流動(dòng)相的黏度，從而對(duì)各砷形態(tài)的分離產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致峰高降低，靈敏度下降。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇用量對(duì)砷形態(tài)分離效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇用量為0～20 mL時(shí)，4種砷形態(tài)的信號(hào)強(qiáng)度與甲醇濃度呈正相關(guān)；當(dāng)甲醇用量為20～40 mL時(shí)，4種砷形態(tài)的信號(hào)強(qiáng)度隨著甲醇濃度的增大而減少，最終選擇最佳甲醇用量為20 mL。

2.4 鹽酸載流體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

在LC-AFS檢測(cè)體系中，載流將液相分離得到的物質(zhì)帶入氫化物發(fā)生器，待產(chǎn)生氣態(tài)砷后進(jìn)入原子熒光進(jìn)行定量檢測(cè)，因此載流濃度直接影響原子熒光基線的穩(wěn)定性。載流濃度與氣態(tài)砷產(chǎn)生效率以及原子火焰的高度也有密切關(guān)系，載流中HCl的主要作用是保證氣態(tài)砷的連續(xù)產(chǎn)生、避免熒光猝滅對(duì)分析系統(tǒng)的影響，從而使整個(gè)反應(yīng)平穩(wěn)、流暢。本實(shí)驗(yàn)以50 μg/L As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA和MMA的標(biāo)準(zhǔn)砷溶液、10 g/L的KBH4還原劑為基礎(chǔ)，考察了不同體積分?jǐn)?shù)(2%～12%)HCl對(duì)砷形態(tài)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，As(Ⅲ)的峰高在2%～7%HCl范圍內(nèi)增幅較大，在HCl體積分?jǐn)?shù)大于7%之后增幅較小；MMA和As(Ⅴ)的信號(hào)強(qiáng)度在載流為5%HCl時(shí)信號(hào)強(qiáng)度最佳，之后隨載流體積分?jǐn)?shù)的增加而減小?？紤]到較高體積分?jǐn)?shù)的HCl對(duì)檢測(cè)儀器的腐蝕較大，為延長(zhǎng)儀器的使用壽命，保持儀器穩(wěn)定性，選擇5%HCl為最佳載流。

2.5 還原劑(KBH4)質(zhì)量濃度的影響

在原子熒光檢測(cè)系統(tǒng)中，KBH4起為砷元素發(fā)生氫化反應(yīng)提供新生態(tài)氫，并與酸反應(yīng)生成氫氣的作用。在原子化器出口與Ar氣結(jié)合形成Ar-H2的混合火焰，從而為原子化提供能量。因此，還原劑的濃度不僅影響砷氫化物的產(chǎn)生效率，還直接關(guān)系到火焰的穩(wěn)定性[17-18]。

若還原劑濃度過(guò)低，氫化物的生成效率下降，產(chǎn)生的Ar-H2-O2原子火焰不穩(wěn)定，將造成熒光強(qiáng)度下降；還原劑濃度過(guò)高，則在管路中產(chǎn)生的H2較多，生成的火焰不穩(wěn)定，會(huì)造成信噪比低，基線漂移。本實(shí)驗(yàn)探討了KBH4溶液質(zhì)量濃度(0～20 g/L)對(duì)砷形態(tài)峰高的影響。結(jié)果表明，當(dāng)KBH4在0～10 g/L范圍時(shí)，各砷形態(tài)的峰高均隨KBH4質(zhì)量濃度的增大而增加；當(dāng)KBH4質(zhì)量濃度大于10 g/L后，峰高相應(yīng)減小，而DMA在KBH415 g/L時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最大，由于DMA在KBH4質(zhì)量濃度為10 g/L和15 g/L時(shí)的信號(hào)響應(yīng)值差別不大，故本實(shí)驗(yàn)選用10 g/L KBH4溶液作為最佳還原劑。

圖3 4種砷形態(tài)混標(biāo)溶液(50 μg/L)的出峰圖Fig.3 Chromatogram of four arsenic species(50 μg/L) mixed standard

在優(yōu)化條件下，各砷形態(tài)在10 min左右得到較好的分離。圖3為4種砷形態(tài)在上述分離條件下的色譜圖。

2.6 方法性能

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線取1 mL總砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(GSB 04-1714-2004)，用超純水定容至500 μg/L，放入4 ℃冰箱中保存。用超純水將砷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋定容制備成質(zhì)量濃度為 15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/L的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 mL。利用ICP-OES測(cè)定總砷標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得該范圍內(nèi)線性方程為Y=0.977X-0.213(其中Y為峰高，X為砷質(zhì)量濃度)，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

取各砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水按一定比例等體積稀釋制備砷形態(tài)混標(biāo)溶液，其中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA混標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為0、12.5、25、50、100 μg/L，AsB為0、20、40、80、160 μg/L。使用100 μL 微量注射器以濃度從低到高的順序?qū)?biāo)準(zhǔn)溶液注入LC-AFS檢測(cè)系統(tǒng)中，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣測(cè)試，得到該范圍內(nèi)各砷形態(tài)的相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

圖4 LC-AFS有無(wú)紫外消解條件下砷的出峰差異圖Fig.4 The difference of arsenic peak by LC-AFS with or without UV digestiona：UV off;b：UV on

在AFS檢測(cè)中，所有被測(cè)砷化物須預(yù)先生成氣態(tài)的砷化合物才能被檢測(cè)。實(shí)際中，AsB等有機(jī)砷并不能直接產(chǎn)生氣態(tài)的砷氫化物，必須通過(guò)紫外消解等手段將其轉(zhuǎn)化成易產(chǎn)生簡(jiǎn)單氣態(tài)砷化合物的形態(tài)[17]。圖4對(duì)比了有無(wú)紫外消解條件下砷的出峰差異。

由圖4可知，4種砷形態(tài)完全分離，AsB峰與As(Ⅲ)峰重疊。但在紫外氧化系統(tǒng)作用下，AsB轉(zhuǎn)化成氣態(tài)砷化合物，可通過(guò)原子熒光進(jìn)行檢測(cè)。這是因?yàn)锳sB無(wú)法直接與NaBH4等反應(yīng)生成氣態(tài)砷氫化物,可通過(guò)As(Ⅲ)和As(Ⅲ)+AsB兩個(gè)峰的峰面積差值來(lái)表達(dá)AsB的含量。本實(shí)驗(yàn)以混標(biāo)中AsB質(zhì)量濃度(0、20、40、80、160 μg/L)為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的As(Ⅲ)和As(Ⅲ)+AsB兩峰的峰面積差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為Y=3.004X+7.179，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，說(shuō)明在0～160 μg/L范圍內(nèi)線性較好。

2.6.2檢出限將總砷和各砷形態(tài)中較低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定6次，以3倍基線噪聲信號(hào)強(qiáng)度確定樣品的檢出限。通過(guò)計(jì)算得到As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsB的儀器檢出限(以As計(jì))分別為0.3、2.1、1.4、1.1、0.7 μg/L，總砷的儀器檢出限為0.8 μg/L。

2.6.3精密度取總砷標(biāo)液和5種砷形態(tài)的混標(biāo)溶液，平行測(cè)定6次考察峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明總砷的RSD為2.6%～4.3%；As(Ⅲ)的RSD為1.6%～2.7%；DMA為1.7%～3.2%；MMA為2.1%～3.1%；As(Ⅴ)為1.8%～3.4%；AsB為2.1%～3.5%。各砷形態(tài)的RSD均較小，表明方法重復(fù)性好，精密度較高。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用建立的方法對(duì)采集的污泥樣品中的砷形態(tài)和總砷進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示污泥中均含有不同量的各類(lèi)砷形態(tài)，5種砷形態(tài)的檢出量為0.6～24.6 μg/L(表2)。

表2 不同樣品中形態(tài)砷含量和總砷含量(n=3)Table 2 Content of arsenic species and T-As in different samples(n=3) (μg/L)

3 結(jié) 論

本文采用微波消解和微波萃取對(duì)污泥樣品中砷形態(tài)進(jìn)行快速預(yù)處理。通過(guò)對(duì)LC-AFS聯(lián)用系統(tǒng)中的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了污泥中As(Ⅲ)、DMA、MMA、As(Ⅴ)和AsB 5種砷形態(tài)的測(cè)定方法。同時(shí)，利用ICP-OES測(cè)定了污泥樣品中總砷含量，結(jié)果與各形態(tài)砷總量接近。本方法精密度高，樣品前處理方法便捷，為環(huán)境樣品中砷形態(tài)的分析提供了技術(shù)基礎(chǔ)。