李正義，邵丹迪，殷 樂(lè)，肖唐鑫，孫小強(qiáng)

(常州大學(xué) 石油化工學(xué)院，江蘇 常州 213164)

金屬離子廣泛存在于自然界和生命體中，其中Zn2+、Fe3+、Cu2+等過(guò)渡金屬離子是人體必需的微量元素，對(duì)人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、氧氣輸送以及細(xì)胞代謝等許多生理及病理過(guò)程起重要作用[1-2]。人體內(nèi)金屬離子過(guò)多或過(guò)少均會(huì)引起生命體征的紊亂，因此，金屬離子的檢測(cè)對(duì)疾病的早期預(yù)防、診斷和治療有著深遠(yuǎn)的意義[3-5]。目前檢測(cè)金屬離子的常用方法有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法和伏安法等[6-8]，但這些儀器操作復(fù)雜且成本高。而熒光探針?lè)ň哂胁僮骱?jiǎn)單快速、成本低、選擇性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)及環(huán)境領(lǐng)域有著重要應(yīng)用[9-12]。近年來(lái)，金屬離子熒光探針的研究引起了廣泛關(guān)注，如萘酰亞胺型[13]、香豆素類[14]、羅丹明類[15]、BMC衍生物[16]等探針?lè)肿訉?duì)某些金屬離子具有很好的熒光識(shí)別性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

ASC-J9(純度>98%)，根據(jù)文獻(xiàn)自制[26]；大豆卵磷脂(生物試劑，德國(guó)Lipoid公司)；膽固醇(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；金屬鹽及其他溶劑均為分析純。

Scientz-750F超聲波分散儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Thermo SL16R超速離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent Cary Eclipse型熒光分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)；ZS90納米粒徑電位分析儀(英國(guó)Malvern公司)。

1.2 水溶性ASC-J9脂質(zhì)體的制備

取大豆卵磷脂0.5 g、膽固醇0.05 g、ASC-J9 5.0 mg，加入適量無(wú)水乙醇溶解后，倒入茄形瓶中減壓蒸除溶劑，再加入75 mL水，置于旋蒸儀上，60 ℃常壓旋轉(zhuǎn)30 min，將瓶壁上的膜完全剝離入水中，水化完全后，置于60 ℃水浴中繼續(xù)孵化3 h，然后冰水浴超聲(525 W)分散15 min，冷卻至4 ℃，高速離心取上層液體，得到ASC-J9脂質(zhì)體，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3 ASC-J9脂質(zhì)體水溶液的配制

圖1 ASC-J9脂質(zhì)體的粒徑分布Fig.1 Particlesize distribution of ASC-J9 liposome

取少量ASC-J9脂質(zhì)體，用乙醇稀釋后進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，分析條件：流動(dòng)相為乙腈 -水(體積比40∶60)，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。根據(jù)建立的ASC-J9乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線得出ASC-J9脂質(zhì)體中ASC-J9的濃度為1.009×10-4mol/L。取5 mL ASC-J9脂質(zhì)體母液于10 mL容量瓶中，加水定容，得到濃度為50 μmol/L的ASC-J9脂質(zhì)體水溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 ASC-J9脂質(zhì)體的表征及水溶性能

采用薄膜分散法，按“1.2”方法制備ASC-J9脂質(zhì)體，利用納米粒徑電位分析儀測(cè)得其平均粒徑為145.7 nm，分散系數(shù)為0.361。ASC-J9脂質(zhì)體的粒徑分布區(qū)間較窄(圖1)，說(shuō)明其粒徑分布均勻，能在水中很好地分散，有效改善了ASC-J9的水溶性。

圖2 水中ASC-J9脂質(zhì)體對(duì)不同金屬離子的熒光響應(yīng)Fig.2 Fluorescent responses of ASC-J9 liposome recognize different metal ions in waterexcitation wavelength：440 nm，25 ℃，550 mV

圖3 不同金屬離子對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Fluorescence intensity of ASC-J9 liposome toward Fe3+ influenced by various metal ions

2.2 ASC-J9脂質(zhì)體對(duì)金屬離子的選擇性識(shí)別及抗干擾能力

在10 mL 濃度為50 μmol/L的ASC-J9脂質(zhì)體水溶液中分別加入200 μL 0.05 mol/L的MCln(M=Ca2+、Na+、K+、Pt2+、Hg2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+)、M(NO3)n(M=Al3+、Ag+、Ba2+、Mn2+、Co2+、Pb2+)、M(OAc)n(M=Ni2+、Zn2+、Cd2+)和CuSO4金屬鹽水溶液，分別測(cè)試其熒光光譜(圖2)。發(fā)現(xiàn)Fe3+、Fe2+及Cu2+對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體有明顯的熒光猝滅作用，除Al3+使ASC-J9脂質(zhì)體的熒光略增強(qiáng)外，其他金屬離子對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體無(wú)明顯的熒光響應(yīng)。

以Fe3+為例，進(jìn)一步考察了常見(jiàn)的其他金屬離子和Fe3+共存時(shí)對(duì)體系中Fe3+識(shí)別的干擾情況。在10 mL濃度為50 μmol/L的ASC-J9脂質(zhì)體水溶液中分別加入200 μL 0.05 mol/L的Fe3+和其他金屬離子，觀察不同共存金屬離子對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+的影響(圖3)。結(jié)果顯示，除Fe2+和Cu2+外，其他金屬離子對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+的影響很小。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+為模型，詳細(xì)優(yōu)化了熒光識(shí)別條件并測(cè)定識(shí)別性能參數(shù)。

2.3 熒光識(shí)別條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體濃度進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)其自身熒光越強(qiáng)，加入Fe3+后猝滅現(xiàn)象越明顯，越有利于可視化觀察。通過(guò)對(duì)比不同濃度(1.0×10-4～1.0×10-6mol/L)ASC-J9脂質(zhì)體水溶液的熒光強(qiáng)度，最終選擇ASC-J9脂質(zhì)體的最佳濃度為5.0×10-5mol/L，此時(shí)獲得的熒光強(qiáng)度最大。

考察了ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+的平衡時(shí)間。在ASC-J9脂質(zhì)體水溶液中加入過(guò)量的Fe3+，測(cè)試該溶液在不同時(shí)間下熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+加入2 min后熒光基本猝滅完全，表明ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+的絡(luò)合速度快。為充分保障作用效果，最終選擇5 min后進(jìn)行熒光測(cè)試。

在ASC-J9脂質(zhì)體水溶液中加入過(guò)量的Fe3+，考察了不同測(cè)試溫度(5～40 ℃)對(duì)熒光強(qiáng)度變化的影響。結(jié)果表明，溫度對(duì)ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+的影響不大，為便于檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)選擇在室溫(25 ℃)下進(jìn)行檢測(cè)。

圖4 ASC-J9脂質(zhì)體(50 μmol/L)熒光強(qiáng)度隨Fe3+濃度的變化Fig.4 Fluorescence intensities of ASC-J9 liposome changed by different concentrations of Fe3+Fe3+：0，10，20，30，40，50，60 μmol/L

2.4 Job’s曲線與熒光滴定

Job’s 曲線是確定探針與金屬絡(luò)合比的常見(jiàn)方法[27]。固定ASC-J9脂質(zhì)體和Fe3+的總濃度為50 μmol/L，改變兩者的濃度比，以Fe3+占兩者總濃度的比例為橫坐標(biāo)，前后兩次熒光強(qiáng)度的差值(ΔIF)為縱坐標(biāo)作圖。結(jié)果表明,當(dāng)Fe3+與ASC-J9脂質(zhì)體的摩爾比為1∶1時(shí)，熒光強(qiáng)度差值最大，由此推斷Fe3+與ASC-J9脂質(zhì)體以1∶1絡(luò)合。

熒光滴定結(jié)果顯示(圖4)，隨著Fe3+的加入，50 μmol/L ASC-J9脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度不斷減小，當(dāng)Fe3+濃度達(dá)50 μmol/L時(shí)，ASC-J9脂質(zhì)體的熒光完全猝滅，進(jìn)一步證實(shí)了兩者的絡(luò)合比為1∶1。

2.5 熒光猝滅類型及結(jié)合常數(shù)

采用Stern-Volmer方程判斷猝滅類型[28]：

(1)

式中，F(xiàn)和F0分別為存在和不存在Fe3+時(shí)ASC-J9脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度；[Q]為Fe3+的濃度；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；Kq為雙分子熒光猝滅常數(shù)；τ0為不存在Fe3+時(shí)ASC-J9脂質(zhì)體的熒光平均壽命。將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)帶入Stern-Volmer方程(式1)，以F0/F為縱坐標(biāo)，F(xiàn)e3+的濃度為橫坐標(biāo)，得到ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+絡(luò)合的Stern-Volmer方程為y=1.59×106x-2.66，r2=0.977 1，由此得出KSV為1.59×106。一般τ0為10-8s，從而計(jì)算出Kq為1.59×1014L/(mol·s)。根據(jù)Kq> 2×1010L/(mol·s)推斷出該熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅。

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線[28]計(jì)算結(jié)合常數(shù)：

(2)

以1/(F0-F)為縱坐標(biāo)，[Q]-1為橫坐標(biāo)作線性回歸方程，得到方程為y=8.145 0×10-9x+7.84×10-4，r2=0.994 6，線性關(guān)系良好。計(jì)算得出ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+的結(jié)合常數(shù)Ka為9.63×104L/mol，說(shuō)明ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+的結(jié)合能力較強(qiáng)。

2.6 ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別Fe3+的線性范圍與檢出限

向ASC-J9脂質(zhì)體水溶液中分別加入一系列不同濃度的Fe3+溶液，測(cè)定對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以Fe3+的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制回歸方程。結(jié)果表明，F(xiàn)e3+的濃度在5.0×10-7～3.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與ASC-J9脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=-15.55x+593.3(r2=0.991 8)。通過(guò)3σ(3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差)的方法[29-30]，得到ASC-J9脂質(zhì)體對(duì)Fe3+的檢出限(LOD)為6.41×10-7mol/L，表明其對(duì)Fe3+的識(shí)別具有較高的靈敏度。

2.7 ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別不同金屬離子的性能參數(shù)對(duì)比

參照上述方法，分別測(cè)得ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+、Fe2+和Cu2+的絡(luò)合比、結(jié)合常數(shù)、檢出限及其線性范圍，結(jié)果如表1所示。ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+和Cu2+的絡(luò)合比均為1∶1，而與Fe2+的絡(luò)合比為2∶1；且ASC-J9脂質(zhì)體與Fe2+的結(jié)合能力最強(qiáng)，結(jié)合常數(shù)為3.65×105L/mol；ASC-J9脂質(zhì)體識(shí)別3種金屬離子的檢出限均較低，檢測(cè)靈敏度較高。

表1 ASC-J9脂質(zhì)體與金屬離子的絡(luò)合比和識(shí)別性能Table 1 Binding ratio and recognition performance of ASC-J9 liposome with metal ions

3 結(jié) 論

本文采用薄膜分散法制備ASC-J9脂質(zhì)體，解決了ASC-J9水溶性差的問(wèn)題，并將其成功用于純水介質(zhì)中金屬離子的熒光識(shí)別。研究結(jié)果表明,ASC-J9脂質(zhì)體能在純水介質(zhì)中通過(guò)熒光猝滅的方式識(shí)別Fe3+、Fe2+和Cu2+。通過(guò)Job’s 曲線和熒光滴定確定ASC-J9脂質(zhì)體與Fe3+和Cu2+的絡(luò)合比均為1∶1，與Fe2+的絡(luò)合比為2∶1；結(jié)合常數(shù)分別為KFe(Ⅲ)=9.63×104L/mol，KFe(Ⅱ)=3.65×105L/mol，KCu(Ⅱ)=2.32×105L/mol；該水溶性熒光探針能快速識(shí)別金屬離子且靈敏度高。本研究進(jìn)一步拓展了ASC-J9的應(yīng)用范圍，為生命體系中金屬離子的檢測(cè)提供了新的思路和參考。