趙童瑤，尹海波，李旭，陶玲，楊婷婷，劉洪嬌

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600)

龍膽作為常用的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1-2]，為龍膽科Gentianaceae植物條葉龍膽GentianamanshuricaKitag.、龍膽GentianascabraBge.、三花龍膽Gentianatriflorapall.或堅(jiān)龍膽GentianarigescensFranch.的干燥根及根莖[3]。在我國廣泛分布，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古，浙江、湖南、江西、福建、江蘇、廣東、新疆也有分布[4]。并且很多種類都具有重要的藥用價(jià)值，藥用資源開發(fā)潛力巨大[5]。其味甚苦，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效，是中醫(yī)治療肝膽疾病的常用藥之一。龍膽臨床使用時(shí)有“味越苦，質(zhì)越優(yōu)”的說法，龍膽中所含的龍膽苦苷，具有強(qiáng)烈苦味活性，是龍膽中藥顯苦寒的主要因素[6-7]。因此苦味可作為評價(jià)龍膽中藥品質(zhì)的主要指標(biāo)。并且由于“入口則知味，入腹則知性”[8]，一直以來中藥味道主要經(jīng)由口嘗獲得，但是由于個(gè)人評價(jià)的感覺差異和描述的主觀性，歷代醫(yī)學(xué)典籍對中藥味道的描述并不一致[9]。現(xiàn)今，人們?nèi)匀豢扛泄賮碓u價(jià)味道，即用人的感覺器官來辨別，獲取藥物的真實(shí)味道。但人為感官描述主觀性強(qiáng)，且量化標(biāo)準(zhǔn)、準(zhǔn)確度和重復(fù)性方面的把握仍有欠缺，而且中草藥的成分分析極其困難。對中草藥成分進(jìn)行定性定量分析，如果僅用傳統(tǒng)的光譜、色譜技術(shù)，將定量化的指標(biāo)對應(yīng)到苦度計(jì)算，將會是一個(gè)耗時(shí)而又費(fèi)力的處理過程。

近年來發(fā)展起來的電子舌(electronic tongue，E-tongue)是一種運(yùn)用味覺指紋分析技術(shù)[10](Gustation Fingerprint Analytical Technique，GFAT)模擬人體味覺器官的仿生學(xué)儀器[11]，是一種分析、識別液體“味道”的新型檢測手段。它是基于味覺傳感器和化學(xué)信息學(xué)處理方法的味覺識別檢測技術(shù)。它得到的是樣品的整體信息，而不是被測樣品中某種或某幾種成分的定性與定量結(jié)果，又被稱作“指紋”數(shù)據(jù)[12-13]。電子舌技術(shù)最早廣泛用于食品領(lǐng)域檢測，但藥食同源，中藥材也是來源于自然界的動(dòng)植物和部分礦物[14]。并且與人體感覺器官舌頭相比，電子舌具有超強(qiáng)的客觀性、良好的重復(fù)性、工作不疲勞、快捷的檢測速度和數(shù)據(jù)電子化等特殊優(yōu)勢[15]。故將電子舌應(yīng)用于對中藥味道的評價(jià)有良好的可行性[16]。基于此我們收集了不同產(chǎn)地的龍膽藥材10份，并利用電子舌技術(shù)對龍膽進(jìn)行苦味與品種及品質(zhì)有無相關(guān)性的分析。

1 材料

1.1 儀器

Aglient 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，F(xiàn)100型粉碎機(jī)(上海高致精密儀器有限公司)，電子天平BP211D(0.01 mg)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，超純水制備儀Milli-Q(密理博(中國)有限公司)，電子舌α-Astree II(7枚電極：ZZ，JE，BB，CA，GA，HA，JB)(法國Alpha MOS公司)

1.2 藥材與試劑

龍膽苦苷對照品；獐牙菜苦苷對照品；獐牙菜苷對照品。龍膽藥材飲片10批，產(chǎn)地分別為來源于云南(購買地為石家莊)、四川、黑龍江、吉林、安徽、云南(購買地為安國)、新賓旺清門、吉林通化、本溪桓仁、清原。

2 實(shí)驗(yàn)方法

α-ASTREE Ⅱ電子舌系統(tǒng)(法國Alpha MOS公司，見圖1)：由第一套傳感器陣列(食品飲料專用，7個(gè)味覺傳感器ZZ，JE，BB，CA，GA，HA，JB和1個(gè)氯化銀參比電極)、16位自動(dòng)進(jìn)樣器、數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)及Alphasoft V12工作站軟件組成。電子舌經(jīng)活化、校正、診斷通過，確保采集得到的數(shù)據(jù)可靠、穩(wěn)定。室溫條件下進(jìn)行測定，每份樣品體積為80 mL。電子舌傳感器在每個(gè)樣品中的采集時(shí)間為120 s，每秒采集1個(gè)數(shù)據(jù)，提取第120 s時(shí)響應(yīng)值作為測定數(shù)值；每測一個(gè)樣品，都在水中清洗10 s，每份樣品重復(fù)測定7次，選取響應(yīng)趨于穩(wěn)定的最后3次的測定數(shù)據(jù)用于計(jì)算。

圖1 龍膽提取物的電子舌測定精密度試驗(yàn)PCA結(jié)果(n=3)

2.1 液相分析分析

2.1.1 供試品溶液的制備 藥材用粉碎機(jī)粉碎，取粉碎的藥材粉末0.3 g，過40目篩然后加入甲醇10 mL超聲30 min。用普通漏斗過濾，取濾液之后再用微孔濾膜過濾。取液裝入EP管中標(biāo)號。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品、獐牙菜苦苷對照品、獐牙菜苷對照品適量，加甲醇超聲溶解定容，搖勻，作為對照品貯備溶液。

2.2 電子舌分析

2.2.1 電子舌粉末制備 取50 g藥材加入10倍量的水，浸泡半小時(shí)，煎煮30 min(煮沸10 min)，將煎出液倒出，再加入8倍量的水，煎煮30 min(煮沸10 min)，將煎出液倒出，再重復(fù)一次，共煎煮3次，合并3次煎煮液。每次煎煮都要加入0.2 g的碳酸鈣以防止酶和有機(jī)酸影響藥材中的活性成分。用小火熬制合并液使其能放入蒸發(fā)皿中，之后用40 ℃水浴加熱成干粉狀稱取1.0 g裝入EP管中標(biāo)明產(chǎn)地。

2.2.2 樣品濃度的確定 電子舌的測定原理為分別測定并記錄7枚電極對樣品溶液的響應(yīng)值，原始數(shù)據(jù)為電勢差。鑒于此原理，電子舌的響應(yīng)值與樣品濃度(基質(zhì)溶液的離子濃度和強(qiáng)度)正相關(guān)，且靈敏度極高。根據(jù)電子舌對中藥提取物的響應(yīng)規(guī)律，常用的樣品測試濃度為0.625～1.000 mg·mL-1，本研究選擇最常用的0.125 mg·mL-1作為供試品測試濃度，測定結(jié)果表明此樣品濃度溶解良好，且濾液放置后無沉淀現(xiàn)象。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取龍膽提取物樣品(1號)約50 mg，精密稱定(52.68 mg)，以水400 mL溶解，過濾，分取5份(每份80 mL)進(jìn)行電子舌測試，記錄測定結(jié)果并計(jì)算樣品測試的精密度。

2.2.4 樣品口感的電子舌測定對10批龍膽提取物供試品溶液，進(jìn)行電子舌測定，記錄測試結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 主成分分析(PCA)是從多個(gè)數(shù)值變量之間的相互關(guān)系入手，利用降維的思想，將多數(shù)變量轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量的分析統(tǒng)計(jì)方法。通過盡可能的保留原有信息量來減少信息維數(shù)，用繁雜的多維數(shù)據(jù)建立有優(yōu)良可視性的2D/3D圖表，原始數(shù)據(jù)中最大量的信息將被投影在PC1軸，其次是PC2，PC3軸。每一個(gè)試樣將在PCA圖上形成一個(gè)集合，各試樣集合之間的距離常常用來表示它們之間的化學(xué)物質(zhì)或者味覺上的相似度。它具有不需要先驗(yàn)知識，并找到一組新的數(shù)軸來最大限度的描述數(shù)據(jù)間的差異性，以此找尋最有用的信息，給出具有不同風(fēng)味區(qū)域和簇的描述性圖表的優(yōu)點(diǎn)。

2.3 高效液相特征圖譜的分析

2.3.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.05%磷酸溶液洗脫，流速：0.7 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：285 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2樣品的高效液相特征圖譜分析 取“2.1.1”項(xiàng)下制備的樣品溶液轉(zhuǎn)移至樣品瓶內(nèi)，進(jìn)樣分析，記錄分析結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 電子舌分析結(jié)果

3.1.1 精密度試驗(yàn)結(jié)果 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7枚電極對樣品的響應(yīng)值測定精密度良好，5份樣品的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合要求(RSD < 2.0%)，測定結(jié)果見表1和圖2。

圖2 龍膽提取物10批樣品的電子舌測定PCA分布圖(n=3)

3.1.2 供試品測定結(jié)果 電子舌7枚電極對10批不同樣品的響應(yīng)值見表2。

3.1.3 樣品的PCA測定結(jié)果 對7枚電極的測定結(jié)果進(jìn)行PCA分析，10批龍膽提取物樣品的口感可以通過2個(gè)主成分PC1和PC2來進(jìn)行表征，分別能代表80.997%和10.37%的電極測定信息。

樣品在結(jié)果的PCA圖上的分布情況見圖3。結(jié)果顯示，第6批樣品和第10批樣品與其余樣品距離較遠(yuǎn)；第6批樣品和第10批樣品之間距離最遠(yuǎn)，第4批樣品和第8批樣品之間距離最近。

PCA圖上樣品之間的相互距離見表3，樣品之間的相對距離遠(yuǎn)近可以暗示其成分組成(口感)的差異大小。

3.1.4 電子舌數(shù)據(jù)聚類分析結(jié)果 9個(gè)不同產(chǎn)地10個(gè)龍膽藥材以主要成分分析獲得4個(gè)公共因子子使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用組間聯(lián)接聚類方法，距離的計(jì)算方法為Euclidean distance，進(jìn)行層次聚類分析，見圖3。

表1 龍膽提取物的電子舌測定精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 龍膽提取物10批的電子舌測定結(jié)果

表3 10批個(gè)不同龍膽提取物樣品電子舌測定PCA圖上相互距離分布表

圖3 電子舌數(shù)據(jù)聚類分析

根據(jù)圖3結(jié)果顯示10個(gè)樣本共分為3 類，其中4號(吉林)，8號(通化)，7號(新賓)，9號(本溪)4個(gè)樣品聚為第一類；1號(云南，產(chǎn)于石家莊)，5號(安徽)，3號(黑龍江)3個(gè)樣品聚為第二類；2號(四川)，6號(云南，產(chǎn)于安國)2個(gè)樣品聚為第三類；10號(清原)單獨(dú)聚為第四類。

從圖3和表2可知，苦度較大的樣品聚在了第一類和第四類，由此可以判斷以上這兩類龍膽藥材味道較苦。

3.2 高效液相特征圖譜的分析結(jié)果

3.2.1 龍膽的高效液相色譜的結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖4)

龍膽苦苷：Y=818.75X+111.72r=0.999 7

獐牙菜苦苷：Y=2 026.1X+2.913 2r=0.999 5

獐牙菜苷：Y=2 277.2X-0.599 7r=0.999 7

圖4 獐牙菜苷，龍膽苦苷，獐牙菜苦混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜

圖5 龍膽樣品的HPLC色譜圖

3.2.2 不同產(chǎn)地龍膽三種有效成分的含量測定 高效液相色譜法測定出十種樣品中有效成分的含量見圖5。

3.2.3 高效液相數(shù)據(jù)聚類分析結(jié)果 9個(gè)不同產(chǎn)地10個(gè)龍膽藥材以主成分分析獲得的4個(gè)公共因子使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，應(yīng)用組間聯(lián)接聚類的方法，Euclidean distance距離的計(jì)算方法進(jìn)行層次聚類結(jié)果的分析見圖6。

表4 不同產(chǎn)地的龍膽有效成分含量

圖6 液相數(shù)據(jù)聚類分析圖

結(jié)果顯示10個(gè)樣本共分為4類。其中5號(安徽)、10號(清原)、4號(吉林)、9號(本溪桓仁)4個(gè)樣品聚為第一類；7號(新賓)、8號(通化)2個(gè)樣品聚為第二類；2號(四川)、6號(云南，產(chǎn)于安國)2個(gè)樣品聚為第三類；1號(云南，產(chǎn)于石家莊)、3號(黑龍江)2個(gè)樣品聚為第四類。

從圖6和表4可知，質(zhì)量較好的樣品聚成了第二類，新賓和通化樣品均聚在這一類，由此可以得出以上兩產(chǎn)地的龍膽藥材質(zhì)量較優(yōu)且穩(wěn)定。

3.3 顯微鑒定藥材品種的結(jié)果

通過電子舌、高效液相和顯微鑒定的結(jié)果分析見表5總結(jié)可以看出新賓、通化和清原的龍膽都屬于龍膽(粗糙)，他們的味道最苦、質(zhì)量最好。

表5 各產(chǎn)地龍膽商品藥材顯微鑒定品種表

4 討論

以前電子舌廣泛的應(yīng)用于食品領(lǐng)域的研究，但隨著醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，基于電子舌對醫(yī)藥的研究也逐年增加。例如在藥品質(zhì)量監(jiān)控，在不同來源的藥物差異性對比，預(yù)估未知中藥提取物濃度和比較中草藥主成分的質(zhì)量優(yōu)劣等方面都有關(guān)聯(lián)[17]。并且電子舌能夠?qū)ξ兜肋M(jìn)行客觀評價(jià)并把相關(guān)成分相互作用的內(nèi)在信息轉(zhuǎn)化成不同味道和質(zhì)量之間的關(guān)系，這使其在客觀表述和控制中草藥外觀氣味信息等方面有著廣泛的應(yīng)用空間[18]，也使得中藥鑒定更加方便。

本研究采用電子舌技術(shù)，對不同產(chǎn)地來源的10批龍膽藥材，采用TS-5000Z電子舌系統(tǒng)自帶的DBMS數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，采用來自傳感器的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行味覺特征分析。對感官評價(jià)數(shù)據(jù)使用SPSS19.0系統(tǒng)進(jìn)行主成分分析和聚類分析。采用HPLC法對龍膽藥材中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷等活性成分進(jìn)行含量測定研究?；诨疑P(guān)聯(lián)度分析法對龍膽藥材苦味與品質(zhì)的相關(guān)性進(jìn)行分析。最后得到了新賓、通化和清源的龍膽都屬于粗糙龍膽，他們的味道最苦、質(zhì)量最優(yōu)的結(jié)果。

目前在傳統(tǒng)中草藥質(zhì)量評估中，人為感覺描述具有較強(qiáng)的主觀性，在量化標(biāo)準(zhǔn)、準(zhǔn)確度和重復(fù)性方面的把握有欠缺，而且中草藥的成分極其繁雜，如果用傳統(tǒng)的光譜、色譜技術(shù)對成分進(jìn)行定性定量，進(jìn)而將定量化的指標(biāo)對應(yīng)到苦度計(jì)算，將會帶來非常繁雜和龐大的處理過程[19]。但利用電子舌分析系統(tǒng)對中藥成分進(jìn)行區(qū)分，剛好能從混沌分析、整體預(yù)測的角度入手，可對樣品中成分定性和定量化分析的過程忽略，賦予樣品味道和電信號的整體信息。引入電子舌為中草藥的快速、便攜、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的篩選和產(chǎn)品化提供了良好的平臺[20]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不但能降低人的感官對中藥味道判斷的模糊性和不準(zhǔn)確性，提高中藥鑒別效率和準(zhǔn)確度；而且可以初步建立以龍膽藥材的苦味來評價(jià)藥材質(zhì)量的方法，為中藥質(zhì)量評價(jià)提供了新的思路和方法。